壯通飲對大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細胞分化作用的研究1）

陳曉鋒，王婧婧，陸 惠

干細胞是機體在發(fā)展適應(yīng)過程中保留的一部分未分化的原始細胞，是具有全部或部分分化能力的細胞，在一定條件下這些干細胞可以增殖和分化成多種功能的細胞或組織器官。內(nèi)源性干細胞（neural stem cells，NSC）是來自機體本身的干細胞，是儲備在人體內(nèi)的巨大修復(fù)潛力的干細胞，側(cè)腦室壁的室管膜下區(qū)和海馬齒狀回的顆粒下區(qū)是內(nèi)源性神經(jīng)干細胞主要集中區(qū)域［1］。內(nèi)源性神經(jīng)干細胞在一定條件下可以分化產(chǎn)生神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞［2］。壯通飲作為臨床治療腦梗死的壯醫(yī)藥經(jīng)驗方，主要由扶芳藤、參三七、黃花倒水蓮三味特色壯藥配伍而成。扶芳藤及參三七有促進干細胞增殖作用，但這些都是拘于對該方中單味藥進行的研究。本實驗通過壯通飲對誘導(dǎo)新生大鼠海馬NSC分化過程的研究，闡明壯通飲促進神經(jīng)再生機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 實驗動物 新生 Wistar大鼠，由廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。

1．2 主要試劑 一抗為鼠抗巢蛋白（Nestin）、神經(jīng)元核心抗原（NeuN）和髓鞘堿性蛋白（MBP）單克隆抗體以及膠原纖維酸性蛋白（GFAP）多克隆抗體（Sigma）；ABC試劑盒、FITC羊抗兔IgG購自武漢博士德生物工程有限公司。

1．3 藥物制備 壯通飲：扶芳藤30g，三七10g，黃花倒水蓮25g。藥材去除雜質(zhì)切制后，按組方劑量配比，加入生藥材10倍量的水，浸泡60min后，用TC－15套式恒溫器250V電壓加熱煎煮。沸騰后將電壓調(diào)低至150V，保持微沸狀態(tài)煎煮1h，濾取煎液。藥渣再加入生藥材8倍量的水，同法煎煮1h，濾取煎液。合并兩次煎液，于恒溫水浴鍋（100℃）蒸發(fā)去水分至濃稠狀，轉(zhuǎn)入恒溫烘箱（60℃）干燥，得干浸膏，稱重，收膏率為36．80%，4℃保存，備用。臨用前使用蒸餾水溶解浸膏至生藥材含量為2．0g／mL。

1．4方法

1．4．1 原代培養(yǎng) 取新生當天 Wistar大鼠，乙醇消毒后斷頭取腦，取雙側(cè)大腦海馬區(qū)于D－Hanks液中，剝離出腦膜及血管，用眼科剪剪碎成糊狀，加DMEM／F12培養(yǎng)液（Hyclone），用細口吸管機械吹打，200目金屬濾網(wǎng)過濾后獲得單細胞懸液并計數(shù)，以5×105／mL的細胞濃度接種到培養(yǎng)瓶中，加入2%B27、終濃度為20ng／mL的EGF和bFGF（均為Gibco產(chǎn)品）后置37℃、5%CO2恒溫孵箱中培養(yǎng)每3d～4d進行半量補液。培養(yǎng)7d～9d后，機械分離神經(jīng)球進行傳代［3］。

1．4．2 傳代培養(yǎng) 將原代培養(yǎng)7d～9d形成的神經(jīng)球（50～200個細胞／球）懸液移至離心管，低速離心后吸棄上清液，機械吹打制成單細胞懸液后，再以5×105／mL細胞密度接種培養(yǎng)。以后每6d～8d傳代1次［4］。

1．4．3 神經(jīng)干細胞分化及壯通飲誘導(dǎo)作用 培養(yǎng)的第2代神經(jīng)球收集，以約2×105／mL的細胞密度接種于24孔培養(yǎng)板各孔中?？椎追胖妙A(yù)先用100mg／L多聚賴氨酸處理過的蓋玻片，每塊培養(yǎng)板分對照組和20mg／L、40mg／L、80mg／L壯通飲組，每組6孔。對照組培養(yǎng)液為原有培養(yǎng)液去除bFGF及EGF，另加10%胎牛血清（FBS）配制。壯通飲組培養(yǎng)液是在對照組培養(yǎng)液基礎(chǔ)上加入壯通飲，濃度分別為20mg／L、40mg／L和80 mg／L。將培養(yǎng)板置飽和濕度、37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

1．4．4 神經(jīng)干細胞鑒定 以神經(jīng)干細胞標志物Nestin鑒定增殖期NSC，并檢測各組分化培養(yǎng)7d時Nestin以及NeuN、GFAP和MBP（分別為神經(jīng)細胞、星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞標志物）表達情況。取出24孔培養(yǎng)板各孔中的蓋玻片，以4%多聚甲醛固定后，0．01mol／L PBS沖洗。檢測Nestin用免疫熒光方法，加一抗37℃孵育60min，F(xiàn)ITC標記的二抗孵育30 min，甘油緩沖液封片后熒光顯微鏡下觀察。余采用免疫細胞化學(xué)ABC改良法。DAB或BCIP／NBT顯色，著棕黃色或紫藍色的細胞為陽性。其中小鼠抗NeuN及兔抗GFAP為1∶500、小鼠抗MBP為1∶200。Olympus倒置顯微鏡及普通光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。在200倍數(shù)下，每個蓋玻片上隨機選5個視野，計算平均陽性細胞數(shù)。

2 結(jié) 果

2．1 NSC的體外原代及傳代培養(yǎng) 培養(yǎng)1d細胞呈圓形亮點，2d～3d可見有數(shù)個細胞形成的啞鈴樣結(jié)構(gòu)，4d～5d可以見到幾十個細胞形成的神經(jīng)細胞球（neurosphere），6d可見神經(jīng)球明顯增大，直徑達100μm～150μm，8d～10d大的神經(jīng)球直徑已達到150μm～200μm。原代及多次傳代培養(yǎng)（目前在本實驗室條件下已傳10代）形成克隆球的細胞圓潤飽滿，邊界清晰，活力狀態(tài)佳，經(jīng)鑒定Nestin表達陽性。

2．2 壯通飲對體外培養(yǎng)神經(jīng)干細胞分化的影響 在去除bFGF及EGF，加10%胎牛血清配制的培養(yǎng)基培養(yǎng)7d后，神經(jīng)干細胞部分分化為NeuN染色陽性的神經(jīng)元、GFAP染色陽性的星形膠質(zhì)細胞和MBP染色陽性的少突膠質(zhì)細胞。NeuN陽性神經(jīng)元的胞體呈圓形或錐體形，有較長軸突。GFAP陽性星形膠質(zhì)細胞的胞體稍小，胞突長而直，分支較少。MBP陽性少突膠質(zhì)細胞的胞體更小，呈扁平狀，突起比神經(jīng)元樣細胞和星形膠質(zhì)樣細胞的少。添加壯通飲培養(yǎng)7d后表達Nestin抗原的陽性細胞數(shù)較對照組明顯增加（P＜0．05），而且表達 NeuN （P＜0．05）、GFAP及MBP的陽性細胞數(shù)較對照組也明顯增多（P＜0．01）。隨壯通飲濃度增加NeuN陽性細胞數(shù)逐漸增多（P＜0．01），但GFAP及MBP陽性細胞數(shù)壯通飲各劑量組無統(tǒng)計學(xué)意義。詳見表1。

表1 壯通飲對神經(jīng)干細胞分化的作用（±s）

表1 壯通飲對神經(jīng)干細胞分化的作用（±s）

與對照組比較，1）P＜0．05；與其他劑量壯通飲組比較，2）P＜0．05

組別Nestin NeuN GFAP MBP對照組16．7±1．5 17．1±1．7 22．4±2．4 5．9±1．4 20mg／L壯通飲組 20．2±1．41） 20．3±1．91） 28．2±3．71） 8．1±2．31）40mg／L壯通飲組 23．6±1．91） 24．5±2．81）2） 28．8±4．01） 8．5±2．61）80mg／L壯通飲組 32．8±2．21） 28．2±3．61） 30．1±3．61） 8．9±3．21）

3 討 論

近年來研究發(fā)現(xiàn)［5］，在哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在NSC，主要分布在海馬、紋狀體、腦室下區(qū)、嗅球以及發(fā)育過程中的大腦皮質(zhì)和脊髓。本實驗應(yīng)用無血清培養(yǎng)技術(shù)從新生大鼠大腦海馬中分離、培養(yǎng)成細胞懸浮球，經(jīng)鑒定呈Nestin陽性。Nestin［6－8］即巢蛋白，又名神經(jīng)上皮干細胞蛋白，屬于中間絲蛋白，主要在神經(jīng)干細胞內(nèi)一過性表達，當干細胞向著終末細胞分化完成后，其表達停止，成熟細胞有著特異的表達標志物，所以巢蛋白被廣泛用于神經(jīng)干細胞的標記物質(zhì)，Nestin陽性表明為神經(jīng)干細胞分化。

體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞與其所處微環(huán)境關(guān)系密切，其中主要因素就是培養(yǎng)基質(zhì)中的各種細胞因子，這些因子的成分和濃度能決定神經(jīng)干細胞的增殖及其分化方向［9，10］。因此，利用某種藥物對體外神經(jīng)干細胞進行定向誘導(dǎo)增殖和分化，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)的治療帶來了新的希望。壯通飲中的扶芳藤對小鼠外周血造血干細胞有明顯的動員作用，并具有作為有效干細胞動員劑的潛力［11］；三七總皂甙可以提高腦梗死患者骨髓干細胞動員率［12］；三七總皂甙能夠促進新生大鼠海馬神經(jīng)干細胞分化，有促進干細胞增殖的作用［13］，但這些都是拘于對該方中單味藥進行研究，壯通飲是否能夠誘導(dǎo)大腦海馬區(qū)NSC增殖分化，迄今缺乏明確的實驗證據(jù)。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，在NSC分化期，添加壯通飲后，表達Nestin抗原的細胞數(shù)較對照組明顯增加，同時表達NeuN、GFAP和MBP的陽性細胞數(shù)量顯著增多。其中NeuN（神經(jīng)元核心抗原）在神經(jīng)元分化成熟后開始表達，是成熟神經(jīng)元的特殊標志物［14，15］；膠原纖維酸性蛋白是星形膠質(zhì)細胞的特征性標志物［16］；髓鞘堿性蛋白是少突膠質(zhì)細胞的特征性標志物［17］。壯通飲能夠促進新生大鼠大腦海馬NSC的分化和增殖。在相同接種密度下對比三種不同劑量壯通飲組分化產(chǎn)生的陽性細胞數(shù)，可以看出在本實驗劑量范圍內(nèi)，壯通飲濃度越大，分化形成的神經(jīng)元細胞越多，而壯通飲對NSC分化為星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞雖有促進作用，但與其濃度的關(guān)系不大。提示壯通飲對NSC尚具有一定的定向誘導(dǎo)分化作用。

本實驗證實，壯通飲能誘導(dǎo)大腦海馬區(qū)NSC分化，具有一定的促進神經(jīng)再生的作用。

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