溫脾通絡(luò)開竅湯對AD大鼠海馬GSK－3β和PP2A活性的影響及作用機制1）

楊進平，吳 林，陳 煒，鄭?？迢卫?，溫惠娟，王青碧，畢信亞

阿爾茨海默?。ˋD）又稱老年性癡呆，是一種以進行性記憶障礙和智能衰退為主要臨床特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾?。?］。AD發(fā)病機制極其復(fù)雜，病因?qū)W尚不清楚，其典型的病理特征是老年斑（SP）形成、神經(jīng)纖維纏結(jié)（NFT）及膽堿能神經(jīng)元的變性、壞死。其中，NFT的數(shù)量和患者的癡呆程度呈明顯的正相關(guān)，被認為是AD患者的神經(jīng)元退化的病理基礎(chǔ)［2］，是AD的核心病理改變。NFT的主要成分是由異常過度磷酸化的tau蛋白聚集而形成的雙螺旋（PHFs）。糖元合成酶激酶3β（GSK－3β）是最重要的催化tau蛋白磷酸化的蛋白激酶之一［3］，GSK－3β在tau蛋白磷酸化及其在AD致病過程的作用及GSK－3β抑制劑在AD防治方面具有潛在作用［4］。而蛋白質(zhì)磷酸酶2A（PP2A）是一種絲／蘇氨酸磷酸酶，能使蛋白質(zhì)脫磷酸，PP2A活性的降低可能是導(dǎo)致AD患者腦中Tau蛋白過度磷酸化的原因［5］。

本實驗應(yīng)用腦立體定向技術(shù)向大鼠海馬注射岡田酸建立AD大鼠動物模型，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測大鼠海馬GSK－3β和PP2A活性，觀察溫脾通絡(luò)開竅湯對其表達水平的影響，探討溫脾通絡(luò)開竅湯抗AD的作用及機制。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 實驗動物 3月齡SPF級雄性SD大鼠60只，體重（200±20）g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動物中心提供（編號：SCXK2007－0002）。

1．1．2 實驗藥品及試劑 溫脾通絡(luò)開竅方（黃芪30g，益智仁10g，三七10g，石菖蒲10g，何首烏10g，絞股藍10g），由江蘇江陰天江藥業(yè)有限公司提供中藥配方顆粒；岡田酸（OA）Sigma公司生產(chǎn)（批號：04511）；二甲亞砜（DMSO）Amresco公司生產(chǎn)（批號：0231）；石杉堿甲，浙江震元制藥有限公司生產(chǎn)（批號：120303）；GSK－3β及PP2A大鼠Elisa試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1．1．3 主要器材和設(shè)備 腦立體定位儀（ST－3ND型腦立體定位），成都儀器廠生產(chǎn)；Morris水迷宮設(shè)備全套（包括Morris水迷宮、電腦攝像系統(tǒng)、配套軟件分析系統(tǒng)），北京中科院生理所生產(chǎn)；酶標(biāo)儀（ELX－800，美國BlO－Tek）。

1．2 實驗方法

1．2．1 造模方法 60只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，大鼠經(jīng)10%水合氯醛3mL／kg腹腔注射麻醉后，固定于大鼠腦立體定位儀上。52只大鼠實施OA右側(cè)的海馬CA1區(qū)注射造模，另8只作為空白對照組。參照George等《大鼠腦立體定向圖譜》，選擇右側(cè)海馬CA1區(qū)，為注射靶區(qū)。用特制三棱針手動鉆顱骨，將溶于10%DMSO的 OA 1．5μL（0．4mmol／L）緩慢注入?？瞻捉M大鼠于相同部位注射等體積的10%DMSO。間隔2d后以相同方法再注射一次。所有大鼠術(shù)后傷口均涂適量紅霉素軟膏，術(shù)后腹腔注射青霉素鈉8×104U／只，以防感染。

1．2．2 Morris水迷宮制作及MWM定位航行實驗 MWM參照相關(guān)文獻制作［6］，將水池等分為4個象限，在第三象限中心放置一黑色平臺，平臺為圓形，直徑11cm，平臺高28cm（稱隱藏平臺）。水迷宮正上方2m高處裝有一個小型攝像機，記錄大鼠逃避潛伏期及跨越平臺次數(shù)。MWM實驗共進行4．5d。定位航行實驗：每天分上下午2個時間段，每個時間段每只大鼠訓(xùn)練4次。每次均隨機順序從不同等分水池的4個起點將大鼠面向池壁放入池中，記錄其60s內(nèi)成功進駐平臺所需時間（即逃避潛伏期）。如在60s內(nèi)大鼠不能成功進駐平臺，則將其引上平臺并令其停留10s，記錄逃避潛伏期為60s，每次訓(xùn)練間隔時間為60s。每一時間段內(nèi)4次潛伏期的算術(shù)均數(shù)作為這一時間段的成績。

1．2．3 AD模型篩選 造模14d后進行AD模型篩選，按照上述定位航行實驗方法，參照趙憲林等［7］的AD大鼠模型篩選標(biāo)準(zhǔn)進行篩選，計算模型組大鼠各時段成績平均逃避潛伏期與參考值之差占該鼠的平均逃避潛伏期時間比例，該值＞20%定為AD大鼠。造模2周內(nèi)造模組大鼠死亡4只，空白組死亡1只。經(jīng)過篩選，造模組48只大鼠符合要求的大鼠40只進行后續(xù)實驗，造模成功率為76．9%。

1．3 分組及給藥劑量 將造模成功的模型組大鼠40只隨機分為溫脾通絡(luò)開竅方高、中、低劑量組，西藥對照組，模型組。每組8只?？瞻捉M7只。造模第20天開始灌胃給藥，給藥量均按人與大鼠體表面積系數(shù)比確定，以臨床人用藥等效劑量作為中劑量，中藥高、中、低劑量組大鼠的給藥劑量分別為4．15g／kg、8．3 g／kg、16．9g／kg，西藥組給藥劑量為3mg／kg。模型組及空白對照組均予相應(yīng)體積的雙蒸水灌胃。各組大鼠按劑量每天灌胃給藥一次，共21d。治療期間，模型組、中藥低劑量組、中藥中劑量組各死亡2只，西藥組、中藥高劑量各死亡1只。

1．4 取材 動物水迷宮后斷頭，冰臺上迅速取腦，分離海馬組織一部分放入－80℃冰箱凍存為下一步實驗備用。另一部分稱其重量，加入一定量的PBS（pH7．4）溶液，用勻漿器將標(biāo)本勻漿 充分，離心20min左右（3 000r／min），收集上清，分裝后放于－80℃待檢測。

1．5 檢測方法 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔8個。每孔中各加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μL。加樣：設(shè)空白孔、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測樣品10μL。溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30min。配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μL，空白孔除外。顯色：每孔先加入顯色劑A 50μL，再加入顯色劑B 50μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光反應(yīng)15min。使用酶標(biāo)儀在450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。

1．6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS15．0分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。對數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗，若方差齊，采用單因素方差分析，若方差不齊則對數(shù)據(jù)進行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換以滿足方差齊性檢驗，若轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)仍未達到方差齊要求，則改用秩和檢驗。

2 結(jié) 果

Elisa結(jié)果，模型組GSK－3β的活性較空白組有提高（P＜0．05），而PP2A的表達兩者相比有降低。中藥低劑量組和西藥組與模型組比較無統(tǒng)計學(xué)意義。中藥高、中劑量組與模型組相比有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），GSK－3β的活性亦明顯低于模型組，而PP2A的表達明顯高于模型組，其中尤以中藥高劑量組的作用最明顯，中藥高、中、低劑量組之間存在一定的量效關(guān)系。詳見表1。

表1 溫脾通絡(luò)開竅法對AD大鼠腦組織GSK－3β和PP2A活性的影響（±s） pg／mg

表1 溫脾通絡(luò)開竅法對AD大鼠腦組織GSK－3β和PP2A活性的影響（±s） pg／mg

與空白組比較，1）P＜0．05；與模型組比較，2）P＜0．05；與西藥組比較，3）P＜0．05

組別 劑量 n GSK－3βPP2A空白組 生理鹽水7 2．69±0．48 9．21±1．87模型組 生理鹽水 6 8．05±1．471） 2．89±0．361）西藥組 3mg／（kg·d） 7 7．87±1．33 3．41±0．63高劑量組16．9mg／（kg·d） 7 6．19±0．772）3） 4．11±0．812）3）中劑量組 8．3mg／（kg·d） 6 7．45±1．052） 3．72±0．742）低劑量組4．15mg／（kg·d） 6 7．98±1．41 3．23±0．48

3 討 論

GSK－3β是一個深受關(guān)注的蛋白激酶［8］，因能夠磷酸化并抑制糖原合成過程中的限帶酶－糖原合成酶（glycogen synthase）而得名。GSK－3β是AD腦中引起Tau蛋白異常過度磷酸化的最主要蛋白激酶，其在AD腦中含量增高，并主要集中于神經(jīng)元纖維纏結(jié)。它主要參與AD的病理形成，主要途徑是使微管相關(guān)蛋白（Tau蛋白）磷酸化，在許多異常磷酸化位點使Tau蛋白磷酸化，Tau磷酸化后導(dǎo)致微管蛋白不穩(wěn)定，并聚集成神經(jīng)纖維纏結(jié)，可致神經(jīng)元可塑性改變及神經(jīng)元退行性變化［9］，GSK－3β在許多異常磷酸化位點使Tau蛋白磷酸化，目前的研究證實，GSK－3β能夠磷酸化Tau蛋白上的10個位點，這一活性能調(diào)節(jié)Tau與微管的結(jié)合，進而影響神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和可塑性。GSK－3β的活性可通過磷酸化調(diào)節(jié)，Ser9磷酸化后活性抑制，而Ty r216磷酸化后活性增高［10］。另外，GSK－3β抑制對星形膠質(zhì)細胞生長錐的延伸和運動性亦是十分重要的。GSK－3β對微管結(jié)合域C端的磷酸化能力較強，且被GSK－3β磷酸化的tau蛋白有更強的成纖維特性［11］。

蛋白質(zhì)磷酸酶2A是一種絲／蘇氨酸磷酸酶，能夠使蛋白質(zhì)脫磷酸，具有多種生物活性。蛋白磷酸酯酶的降低，特別是PP2A活性的降低可能是導(dǎo)致AD腦中tau以及其他蛋白過度磷酸化的原因［6］。具有代謝活性的大鼠腦片和轉(zhuǎn)基因動物模型研究表明，PP2A的活性降低不僅僅導(dǎo)致其催化tau去磷酸化的能力下降，而且還可通過激活cAMP依賴性蛋白激酶（PKA）、應(yīng)激激活的蛋白激酶和鈣／鈣調(diào)蛋白依賴性的蛋白激酶Ⅱ（CaMK2Ⅱ）和應(yīng)激激活蛋白激酶等激酶的活性來引起tau的異常過度磷酸化。實驗研究還發(fā)現(xiàn)，AD患者腦中磷酸酶PPI，PP2A和PP2B的活性均明顯低于正常腦，特別是PP2A的活性丟失嚴(yán)重，而蛋白激酶的活性則顯著升高。張魁華等［12］發(fā)現(xiàn)，AD模型組大鼠腦組織神經(jīng)元表達脫磷酸的磷酸酯酶PP2A明顯減少，降低程度為正常的66%左右，而溫脾通絡(luò)開竅方治療組可以使這種現(xiàn)象得到改善。

本實驗采用岡田酸海馬區(qū)注射制作AD模型，通過ELISA方法檢測大鼠海馬GSK－3β和PP2A的活性，模型組大鼠海馬GSK－3β的水平較空白組有明顯降低，中藥組各組GSK－3β的水平較模型組有所下降，其中高、中劑量組作用明顯。模型組大鼠海馬PP2A的水平較空白組有明顯升高，中藥組各組PP2A的水平較模型組有所升高，其中高、中劑量組作用明顯。從以上可以看出，本實驗中藥組之間存在一定的量效關(guān)系，溫脾通絡(luò)開竅方在一定劑量范圍內(nèi)可以抑制GSK－3β和提高PP2A的活性，降低AD模型大鼠Tau異常磷酸化的水平，故溫脾通絡(luò)開竅方具有抗AD的治療作用。

由于AD發(fā)病機制復(fù)雜，單一作用點藥物很難取得滿意效果，目前仍缺乏有效的防治藥物，臨床主要用膽堿酯酶抑制劑，但也只能改善早、中期患者的部分癥狀。而中醫(yī)藥不但在緩解衰老及衰老相關(guān)疾病的防治方面有著豐富的理論和實踐經(jīng)驗，且其還具有多途徑、多方式、多靶點特征。本研究結(jié)果也體現(xiàn)了溫脾通絡(luò)開竅湯多靶點、多途徑的優(yōu)勢。

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