抗栓中藥血栓心脈寧片對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞全基因表達(dá)譜的影響

劉建偉，張曉天，張 超，賽景影，王鑫磊，王槐棟，王 放

血栓性疾病因其較高的發(fā)病率及致死率成為嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一［1］。中藥具有多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)，且不良反應(yīng)小等優(yōu)勢(shì)，在預(yù)防血栓形成、治療血栓性疾病等方面具有良好的效果［2－4］?？顾ㄖ兴幦缪ㄐ拿}寧（XXT）具有活血化瘀，擴(kuò)張血管，抑制血小板聚集，降低血黏度，降低血脂，改善局部和全身血液循環(huán)及防治血栓的功效［3］。國(guó)內(nèi)外已出現(xiàn)不少將基因芯片技術(shù)應(yīng)用到中藥藥理機(jī)制研究中的報(bào)道［5］。這為抗栓中藥的抗栓分子藥理機(jī)制的研究開辟出了新的發(fā)展前景。利用高密度基因芯片檢測(cè)中藥給藥前后基因表達(dá)譜的差異是開展中藥分子藥理研究的主要思路。

本研究觀察人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）給藥前后的基因表達(dá)譜差異，探索抗栓中藥XXT對(duì)HUVEC的作用，為抗栓中藥的藥物研發(fā)和國(guó)際化應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 試劑及儀器 HUVEC來自吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室凍存；血栓心脈寧片購自吉林華康藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20030145，產(chǎn)品批號(hào)：110601；IMDM培養(yǎng)基購自HyClone；總RNA快速提取試劑盒購自BioTeke；NucleoSpin RNA clean－up試劑盒購自 Macherey－Nagel；晶芯?cRNA擴(kuò)增標(biāo)記試劑盒購自CapitalBio；35KHuman Genome Array購自CapitalBio；PrimeScript?RRT reagent Kit購自 TaKaRa；SYBR?RPremix Ex Taq TM 購自 TaKaRa；雙通道激光掃描儀購自CapitalBio；ABI 7300型熒光定量 PCR儀購自 Applied Biosystems。

1．2 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 HUVEC細(xì)胞用含15%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)液在37℃、95%氧、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底后，采用0．25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，每2d～3d傳代一次。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組及XXT給藥組。正常對(duì)照組加入含2%血清的IMDM培養(yǎng)液，XXT給藥組給予終濃度為2．5mg／mL XXT的含2%血清IMDM培養(yǎng)液培養(yǎng)24h。

1．3 總RNA提取 采用總RNA快速提取試劑盒提取正常對(duì)照組及XXT給藥組HUVEC的總RNA，并進(jìn)一步采用NucleoSpin?RNA clean－up試劑盒對(duì)總RNA進(jìn)行過柱純化，最后用紫外分光光度計(jì)定量，甲醛變性膠電泳質(zhì)檢。

1．4 RNA熒光標(biāo)記與雜交 RNA反轉(zhuǎn)錄合成1st－strand cDNA及2nd－strand cDNA，再以cDNA為模板合成cRNA，隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄，cDNA用KLENOW酶標(biāo)記。標(biāo)記的DNA溶于80μL雜交液中，于42℃雜交過夜，芯片洗滌后即可用于掃描。1．5 芯片掃描與分析 芯片采用LuxScan 10KA雙通道激光掃描儀進(jìn)行掃描，并用LuxScan 3．0軟件分析，片間校正，片內(nèi)歸一化，根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度和圖像質(zhì)量對(duì)基因進(jìn)行標(biāo)記，篩選差異表達(dá)基因。

1．6 差異表達(dá)基因的Real Time－PCR驗(yàn)證 對(duì)芯片結(jié)果篩選出的可能與藥物抗血栓作用相關(guān)的差異表達(dá)基因血紅素氧化酶（HMOX1）、RHOT1、集落刺激因子2（CSF2）和 ANXA8進(jìn)行Real Time－PCR驗(yàn)證。引物合成均在上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。詳見表1。

表1 引物序列合成

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，去除偏移較大的熒光信號(hào)，采集信號(hào)強(qiáng)度（cy3或cy5）大于800的基因。芯片數(shù)據(jù)分析采用博奧公司提供的數(shù)據(jù)軟件包進(jìn)行t檢驗(yàn)，并用MAS3．0進(jìn)行pathway分析。

2 結(jié) 果

2．1 總RNA提取 正常對(duì)照組及XXT給藥組HUVEC提取總RNA后，經(jīng)瓊脂糖凝膠甲醛變性電泳顯示三條清晰的總特征條帶：28s、18s、5s，且28s、18s兩條帶亮度比接近于2∶1，5s條帶較暗，紫外分光光度儀測(cè)定：A260／A280值1．8～2．0之間，表明總RNA提取質(zhì)量較好，未明顯分解。

2．2 差異表達(dá)基因的篩選及生物學(xué)信息分析 比較芯片cy5和cy3的Ratio值并結(jié)合各生物學(xué)重復(fù)Ratio的均值篩選出表達(dá)基因，XXT給藥組與正常對(duì)照組相比，有2 130個(gè)基因差異表達(dá)，其中790條基因出現(xiàn)顯著表達(dá)上調(diào)，1 340條基因出現(xiàn)顯著表達(dá)下調(diào)。經(jīng)MAS對(duì)所得到的差異表達(dá)基因進(jìn)行功能分析，發(fā)現(xiàn)多種基因與細(xì)胞的凋亡調(diào)控、氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎性反應(yīng)及抗凝因子等相關(guān)的基因。詳見表2、表3。

表2 XXT處理HUVEC后表達(dá)上調(diào)的基因

表3 XXT處理HUVEC后表達(dá)下調(diào)的基因

2．3 Real Time－PCR結(jié)果 選取 HMOX1、RHOT1、CSF2及ANXA8等參與細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激反應(yīng)及抗凝血等基因進(jìn)行Real Time－PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果與基因芯片結(jié)果一致。詳見表4、圖1。

表4 芯片差異表達(dá)基因的選取

圖1 Real Time－PCR驗(yàn)證結(jié)果

3 討 論

血栓性疾病并發(fā)性疾病主要包括急性心肌梗死、腦血栓、肺靜脈栓塞、動(dòng)脈血栓和缺血性休克等，心腦血管疾病死亡者居各類死因之首［6］。

血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷與多種心血管疾病如動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、血栓形成等密切相關(guān)［7］。目前，HUVEC在某些方面具有與動(dòng)脈血管內(nèi)皮生物學(xué)特征相似的優(yōu)點(diǎn)而成為體外實(shí)驗(yàn)研究的重要研究對(duì)象［8－10］。

中藥能促進(jìn)細(xì)胞釋放血管活性物質(zhì)、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖及減少細(xì)胞凋亡等方面保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞［11，12］。近年來，隨著生物信息學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，利用高密度的基因芯片檢測(cè)中藥給藥前后基因表達(dá)譜的差異逐漸成為中藥分子藥理研究的主要思路［5］。Wen等［13］對(duì)中藥復(fù)方制劑四物湯抗乳腺癌的作用機(jī)制及藥物關(guān)聯(lián)圖譜進(jìn)行了研究，利用基因芯片分析經(jīng)四物湯處理前后MCF－7癌細(xì)胞株基因表達(dá)譜的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)四物湯的細(xì)胞毒作用是通過多種分子機(jī)制來實(shí)現(xiàn)的，其中Nrf2信號(hào)傳導(dǎo)通路起到了重要作用，與HMOX1，GCLC，GCLM，SLC7A11和NQO1等基因的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。Wang等［14］利用基因芯片分析傳統(tǒng)中藥PHY906及CPT－11抗結(jié)腸癌的作用機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PHY906可通過多種途徑抑制腫瘤生長(zhǎng)。

本實(shí)驗(yàn)利用基因芯片技術(shù)經(jīng)篩查并驗(yàn)證抗栓中藥作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的分子作用靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，XXT作用內(nèi)皮細(xì)胞24 h后，基因芯片分析篩選出差異表達(dá)大于1．5倍的基因2 130個(gè)，其中上調(diào)基因689個(gè)，下調(diào)基因1 399個(gè)，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞黏附、抗凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等相關(guān)基因，說明XXT對(duì)HUVEC的保護(hù)作用是一個(gè)多基因、多途徑的復(fù)雜過程，它包含了多種基因的相互作用及其調(diào)控蛋白的差異。上調(diào)基因中ANXA5、CSF2、HMOX1、CLCF1及 NRG1等基因參與細(xì)胞凋亡的負(fù)調(diào)控作用；ANXA5、TFPI、TFPI 2等基因具有抗凝功能；GCLM、FOS、HMOX1、PPP1R15B等基因參與調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)；CSF2、FOS、CXCL 1、CXCL2及 CXCL3等基因參與調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)；CITED2等基因可調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮的生成。XXT可通過上調(diào)此類基因的表達(dá)量來抑制HUVEC凋亡及氧化應(yīng)激反應(yīng)、促進(jìn)血管內(nèi)皮新生、抵抗血液凝固，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，防治血栓形成。下調(diào)基因中，AKTIP、RHOT1等基因參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡；DHRS3、CRYZ等基因參與氧化還原酶的代謝作用；ANXA8、F8等基因參與調(diào)控體液水平。XXT可通過下調(diào)此類基因的表達(dá)量來抑制HUVEC凋亡、調(diào)節(jié)氧化還原代謝過程及體液水平等來達(dá)到抗血栓的作用。藥物作用涉及細(xì)胞凋亡、氨基酸代謝及生物合成、Toll樣受體、Jak－STAT等信號(hào)傳導(dǎo)通路。提示XXT主要通過調(diào)節(jié)凋亡、炎癥反應(yīng)、抗凝學(xué)等基因及相關(guān)傳導(dǎo)通路來發(fā)揮抗血栓作用。

為進(jìn)一步驗(yàn)證基因芯片結(jié)果的可靠性，本研究對(duì)部分參與細(xì)胞氧化損傷反應(yīng)、細(xì)胞凋亡及抗凝血等相關(guān)的差異表達(dá)基因中的上調(diào)基因CSF2、HMOX1及下調(diào)基因RHOT1、ANXA8進(jìn)行驗(yàn)證，其結(jié)果與基因芯片的檢測(cè)結(jié)果一致。其中CSF2也被稱為及粒細(xì)胞－巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM－CSF），PK13／Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，凋亡相關(guān)蛋白Bcl－2和Bax及一氧化氮都是其重要的下游因子，CSF2能夠刺激多能干細(xì)胞和早期紅細(xì)胞的增殖和分化，加速血管新生［15，16］。本研究中，XXT使CSF2的基因表達(dá)上調(diào)，推測(cè)該藥可能通過抑制細(xì)胞凋亡，舒張血管來達(dá)到保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用。HMOX－1是血紅素氧化的限速酶，可被創(chuàng)傷應(yīng)激、內(nèi)毒素、缺氧等因素誘導(dǎo)，產(chǎn)生鐵蛋白、膽紅素、CO等產(chǎn)物，通過抑制血管收縮等作用保護(hù)組織細(xì)胞，還可通過鳥苷酸環(huán)化酶活化P38有絲分裂原活化MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，激活蛋白C系統(tǒng)，在血栓形成過程中起抗凝作用。HMOX－1還有防止血管平滑肌細(xì)胞過度增生、抗血小板聚集、抗凋亡、誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞中抗凝血酶的合成等作用［17，18］。推測(cè)XXT可能通過上調(diào)該基因達(dá)到防治血栓的作用。RHOT1屬于線粒體Rho GTPases家族成員之一，目前研究發(fā)現(xiàn)RHOT1參與線粒體的穩(wěn)態(tài)及細(xì)胞凋亡［19，20］。本研究中，XXT誘導(dǎo)RHOT1表達(dá)下調(diào)，推測(cè)藥物通過抑制細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗栓作用。Annexin A8（ANAX8）是Annexin家族蛋白成員之一，是一類鈣離子依賴的磷脂結(jié)合蛋白，在細(xì)胞生長(zhǎng)、維生素D及胞外分泌等信號(hào)傳導(dǎo)途徑中起到了重要作用［21，22］。本研究中XXT可使ANAX8表達(dá)下調(diào)，推測(cè)XXT可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)及內(nèi)皮細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子含量來發(fā)揮其藥物作用。

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