三黃雞ST6基因的半定量RT－PCR分析

周 飛，于 夢(mèng)，劉榮昌，袁遠(yuǎn)華，寧章勇

（1．華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州510626）

唾液酸（Sialic acid，SA）是神經(jīng)氨酸的衍生物，作為流感病毒的受體，唾液酸與流感病毒的血凝素（HA）相結(jié)合，介導(dǎo)流感病毒侵入機(jī)體的細(xì)胞。唾液酸以α2，3或α2，6鍵連接于聚糖或糖脂上，在流感病毒的侵入和流感的發(fā)生與發(fā)展中起著關(guān)鍵作用［1－2］。唾液酸是由唾液酸轉(zhuǎn)移酶以9－磷酸－N－乙酰神經(jīng)氨酸或9－磷酸去氨基神經(jīng)氨酸為底物催化而來(lái)的［3－5］，不同的亞型又對(duì)不同的糖鏈或脂鏈有相應(yīng)的偏嗜性［6］。禽流感病毒偏嗜與SAα2，3Gal結(jié)合，人流感病毒偏嗜與SAα2，6Gal結(jié)合［7－9］，這一特點(diǎn)在很大程度上限制了流感病毒的跨物種傳播。此外，唾液酸還可以作為病原微生物逃逸宿主免疫系統(tǒng)的分子模擬器［9］。唾液酸轉(zhuǎn)移酶表達(dá)豐度的高低直接影響了唾液酸的分布與密度，所以唾液酸轉(zhuǎn)移酶的上調(diào)和下調(diào)對(duì)動(dòng)物機(jī)體對(duì)流感病毒的感染及流感的發(fā)生與發(fā)展起著重要的作用。本文首次通過(guò)NCBI上已公布的雞的ST6序列設(shè)計(jì)了引物。通過(guò)RT－PCR克隆了雞的ST6GalⅠ序列和ST6GalⅡ序列，并檢測(cè)了ST6基因的表達(dá)譜。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料 1月齡的三黃雞來(lái)自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)院禽病教研室，經(jīng)檢測(cè)未見(jiàn)禽流感的感染。處死后取其心，肝，脾，肺，腎，腦，腔上囊，胸腺組織。組織樣品凍存于液氮中，用于總RNA的提取。

1．2 總RNA的提取 取液氮中的組織樣品150 mg，在液氮中研碎后，用Trizol法提取總RNA。溶于無(wú)RNA酶的水中，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 逆轉(zhuǎn)錄RT反應(yīng)的具體過(guò)程參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，逆轉(zhuǎn)錄RT反應(yīng)的總體系為20μL。逆轉(zhuǎn)錄出的cDNA放于－80°保存?zhèn)溆谩?/p>

1．4 半定量RT－PCR 半定量RT－PCR的內(nèi)參基因?yàn)殡u的β－actin基因（登錄號(hào)：NM＿205518）。上游引物為5′－GAGGCTACAGCTTCACCACCACA－3′，下游引物為：5′－CCACAGGACTCCA TACCCAAGAA－3′，擴(kuò)增基因片段長(zhǎng)度為232bp，退火溫度：59℃。用于半定量ST6GalⅠ（登錄號(hào)：NM＿205241）的上游引物為：5′－GTGAAATGGGTCAGATGCCTAAA－3′，下游引物為：5′－CCATTAAACCGCAAGACAGCATC－3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度為463 bp，退火溫度：56℃；ST6GalⅡ（登錄號(hào)：NM＿001167747）的上游引物為：5′－TGAGGAGAAGGAGCACAAAGC ACAG－3′，下游引物為：5′－CCAGCAGACATAACTACGGCACAGC－3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度為391bp，退火溫度：55℃。其中β－actin和ST6的反應(yīng)擴(kuò)增體系都為25μL，其中10×PCR Buffer 2．5μL ，dNTPs 2μL（各2．5mmol／L），上游引物和下游引物各1μL（20μmol／L），0．2μL ExTaq酶（5U／L－），模板cDNA 2．5μL，超純水15．8μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃ 預(yù)變性10min；94℃ 變性30s；52℃退火40s；72℃延伸40s，經(jīng)過(guò)一定循環(huán)數(shù)后與72℃總延伸10min；－20℃保存。其中反應(yīng)循環(huán)數(shù)采用28、29、30、31、32、33、34、35個(gè)［10］共8個(gè)不同循環(huán)數(shù)擴(kuò)增ST6和β－actin基因，篩選用于半定量的最適反應(yīng)循環(huán)數(shù)。反應(yīng)產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)照相，半定量分析軟件用Gel－Proanalyzer 4 進(jìn)行，計(jì)算 ST6 與 β－actin 的比值，比值表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

利用ST6特異性引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示，所擴(kuò)增的ST6基因和β－actin基因片段的大小與預(yù)期的相符，測(cè)序結(jié)果顯示所克隆的片段為三黃雞ST6基因和β－actin基因片段。

最佳循環(huán)數(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，ST6和β－actin基因在28～35循環(huán)數(shù)之間均出現(xiàn)目的條帶且基因產(chǎn)量呈線性擴(kuò)增，沒(méi)有進(jìn)入平臺(tái)期。為了獲得理想的試驗(yàn)結(jié)果，將試驗(yàn)中ST6和β－actin的半定量PCR循環(huán)數(shù)優(yōu)化為33個(gè)循環(huán)（圖1和圖2）。

取等量不同組織的總RNA，經(jīng)過(guò)RT－PCR 33個(gè)循環(huán)擴(kuò)增。經(jīng) Gel－Proanalyzer 4分析后表明，ST6基因在三黃雞的8個(gè)組織中均有表達(dá)，其中ST6GalⅠ在心臟中表達(dá)最高，腦中最低；ST6GalⅡ在胸腺中表達(dá)最高，在肝臟中表達(dá)最低，而ST6GalⅠ在各組織中的表達(dá)比其相應(yīng)組織中的ST6GalⅡ的表達(dá)要低（圖2）。

3 討論

作為糖基轉(zhuǎn)移酶成員之一的唾液酸轉(zhuǎn)移酶，在唾液酸的合成中起著重要作用。ST6主要催化α2，6唾液酸的合成，且其偏嗜使Ⅱ型聚糖鏈（Galβ1，4GlcNAc2R）唾液酸化，唾液酸轉(zhuǎn)移酶在組織中的豐度直接影響著唾液酸在不同組織中的分布。

本研究根據(jù)GenBank上的ST6所公布的序列，設(shè)計(jì)引物，成功對(duì)三黃雞ST6GalⅠ和ST6GalⅡ基因進(jìn)行了組織表達(dá)譜的分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ST6基因在心、肝、脾、肺、腎、腦、腔上囊、胸腺這8種組織中都有表達(dá)，ST6GalⅠ在心表達(dá)量最高，在腦表達(dá)最低，其表達(dá)量從高到底依次為：心、脾、肝、胸腺、腎、腔上囊、肺、腦；ST6GalⅡ在胸腺表達(dá)量最高，在肝表達(dá)最低，其表達(dá)量從高到底依次為：胸腺、腔上囊、肺、腎、脾、腦、心、肝。Smitha PS Pillai，馬明［11－12］等人通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢查到SAα2，6Gal在雞各組織中的分布，本研究的結(jié)果與其相似。本研究在mRNA水平上證實(shí)了ST6的表達(dá)，至于SAα2，6Gal是由ST6GalⅠ還是ST6GalⅡ亦或是由兩種酶同時(shí)催化而成的，還需要進(jìn)一步研究。

由于唾液酸是流感病毒侵入機(jī)體的受體，而唾液酸轉(zhuǎn)移酶又是催化唾液酸和糖鏈合成的關(guān)鍵酶，所以曹文雁［13］、van Wielink R［14］等人通過(guò)提高唾液酸轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)豐度，從而提高了細(xì)胞培養(yǎng)流感病毒的滴度。所以本研究對(duì)ST6基因的兩個(gè)亞型在各組織間表達(dá)豐度進(jìn)行了比較，為流感病毒入侵細(xì)胞機(jī)制的研究和發(fā)展受體依賴(lài)性流感病毒細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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