體外法評(píng)定大豆低聚糖對(duì)乳酸菌增殖和抑菌效果的影響

王 晶，季海峰，王四新，張董燕，劉 輝，王雅民

（北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100097）

乳酸菌類微生態(tài)制劑具有良好生物學(xué)功能和益生特性，近年來(lái)受到研究者廣泛關(guān)注。大量研究已證實(shí)乳酸菌制劑在動(dòng)物生產(chǎn)中應(yīng)用，可以抑制腸道病原菌繁殖，從而防止動(dòng)物腹瀉、增加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用率、提高其生產(chǎn)性能[1-2]。但是，這些益生作用顯著菌株在通過(guò)動(dòng)物胃腸道前消化道時(shí)易被酸性環(huán)境破壞，導(dǎo)致到達(dá)后腸段存活率低、有效菌數(shù)少，同時(shí)飼料加工、運(yùn)輸過(guò)程，以及保存方式等對(duì)其存活率也有很大程度影響。因此，限制了乳酸菌類益生菌制劑益生作用有效發(fā)揮。有研究表明雖然益生素寡糖本身不具有營(yíng)養(yǎng)作用，不能被動(dòng)物消化道吸收利用，但其到達(dá)消化道后腸段后能被其中有益微生物選擇性地利用，從而促進(jìn)腸道有益菌群增殖，起到改善宿主健康、提高生產(chǎn)性能作用。近年來(lái)已有研究將乳酸菌與寡糖進(jìn)行配伍使用以提高益生菌益生效果。

大豆低聚糖（Soybean oligosaccharides，SBOS）是大豆中含有2～10個(gè)單糖基低分子糖類總稱，其主要成分是水蘇糖、棉子糖和蔗糖。大豆低聚糖來(lái)源廣泛，其特性及生理保健功能近年來(lái)得到廣泛研究與開(kāi)發(fā)[3]。以往研究表明，大豆低聚糖對(duì)不同菌株促進(jìn)生長(zhǎng)作用結(jié)果不盡相同[4]。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum ZPL001）是本試驗(yàn)室從健康仔豬腸道中成功分離的一株有益菌株。前期研究結(jié)果表明，大豆低聚糖是可被植物乳桿菌ZLP001選擇性利用低聚糖之一。為進(jìn)一步研究植物乳桿菌與大豆低聚糖實(shí)際配伍效果，獲得更有效合生素產(chǎn)品，主要從體外探討大豆低聚糖代替葡萄糖作為培養(yǎng)基碳源對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)和抑菌效果影響，探尋促進(jìn)益生菌生長(zhǎng)有效途徑，為植物乳桿菌與寡糖科學(xué)配伍和更有效合生素產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株及寡糖

研究所用植物乳桿菌ZLP001（Lactobacillus plantarum ZLP001）為本試驗(yàn)室分離自健康仔豬腸道，已通過(guò)中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心鑒定。大豆低聚糖（Soybean oligosaccharides,SBOS）購(gòu)自山東荔諾生物科技有限公司，純度為90%。

1.2 培養(yǎng)基

植物乳桿菌活化和平板計(jì)數(shù)用MRS培養(yǎng)基，大腸桿菌、金色葡萄球菌和沙門氏菌活化和抑菌圈測(cè)定用Mueller Hinton培養(yǎng)基。

1.3 試驗(yàn)方法

活化：將植物乳桿菌凍存菌液以1%接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)18 h備用（活菌數(shù)相當(dāng)于109CFU·mL-1）。抑菌試驗(yàn)指示菌（大腸埃希菌、豬霍亂沙門菌、金黃色葡萄球菌）種子菌液以1%接種量分別接種于MH液體營(yíng)養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)18 h備用（活菌數(shù)相當(dāng)于109cfu · mL-1）。

增殖試驗(yàn)：以不同劑量大豆低聚糖代替葡萄糖作為MRS培養(yǎng)基碳源，添加濃度分別為0%，1%，3%，5%，7%（m/V），進(jìn)行植物乳桿菌ZLP001體外培養(yǎng)，溫度為37℃。分別于培養(yǎng)后0、3、6、9、12和24 h測(cè)定發(fā)酵液pH值、OD600nm值和乳酸生成量，并于24 h測(cè)定活菌數(shù)，以確定最適添加比例。

生長(zhǎng)曲線：通過(guò)上述試驗(yàn)，確定大豆低聚糖作為碳源在MRS培養(yǎng)基中最適添加比例。按1%接種量，將活化好菌液接種到已滅菌以大豆低聚糖為碳源MRS液體培養(yǎng)基中，采用Bioscreen全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀（謂載國(guó)際集團(tuán)（香港）有限公司）連續(xù)測(cè)定48 h。測(cè)定條件為37℃，每隔1 h測(cè)定一次菌液OD600nm。

抑菌試驗(yàn)：在滅菌平板中，注入10 mL 2%滅菌瓊脂，冷凝后，放入已滅菌牛津杯，再將含有1%已活化并稀釋至106指示菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基20 mL注入平板，冷凝后取出牛津杯?？字凶⑷?00 μL已用葡萄糖和大豆低聚糖分別培養(yǎng)植物乳桿菌發(fā)酵液、離心上清液或沉淀后菌懸液，無(wú)糖培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。平板放置在4℃擴(kuò)散4 h，37℃培養(yǎng)10 h后，測(cè)量抑菌圈直徑，每個(gè)處理做3次重復(fù)。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

OD600nm測(cè)定：于接種后0、3、6、9、12、24 h取發(fā)酵液用UV-4802型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海尤尼柯儀器有限公司）測(cè)OD600nm值，以未接種培養(yǎng)基作為空白對(duì)照調(diào)零。

pH值測(cè)定：于接種后0、3、6、9、12、24 h使用pH 213型酸度計(jì)（北京哈納公司）測(cè)定發(fā)酵液pH值。

乳酸濃度測(cè)定：乳酸濃度測(cè)定參照張龍翔等[5]方法進(jìn)行。分別取發(fā)酵0、3、6、9、12、24 h后發(fā)酵液于-20℃保存，比色法測(cè)定乳酸濃度。

平板計(jì)數(shù)：取一定時(shí)間發(fā)酵液，采用10倍梯度倍比稀釋法對(duì)其進(jìn)行稀釋，用MRS培養(yǎng)基以平板涂布法對(duì)植物乳桿菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。平板于37℃培養(yǎng)48 h計(jì)數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS（13.0）軟件One-Way ANOVA程序進(jìn)行顯著性分析，圖中數(shù)據(jù)標(biāo)注標(biāo)準(zhǔn)差，表中數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆低聚糖作為碳源對(duì)植物乳桿菌OD值影響

圖1顯示不同濃度大豆低聚糖作為碳源對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵液OD600nm值影響。從圖可以看出，隨著圖1培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，添加大豆低聚糖發(fā)酵液OD600nm值均呈明顯上升趨勢(shì)，24 h時(shí)，添加不同濃度大豆低聚糖OD600nm值分別為1.69、1.78、1.58、1.36。沒(méi)有添加糖對(duì)照組增速則非常緩慢，到24 h時(shí)，其OD值僅為0.40。說(shuō)明大豆低聚糖添加對(duì)植物乳桿菌體外生長(zhǎng)有明顯促進(jìn)作用。當(dāng)寡糖添加比例達(dá)到3%或5%時(shí)，植物乳桿菌增殖效果最好，24 h活菌數(shù)可以達(dá)到109cfu·mL-1以上。而當(dāng)大豆低聚糖添加比例達(dá)到7%時(shí)，植物乳桿菌生長(zhǎng)有明顯降低，僅為108cfu·mL-1。

圖1 不同濃度大豆低聚糖對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵液OD600nm影響Fig.1 Effect of different level of soybean oligosaccharide on OD600nmof fermentation broth of Lactobacillus plantarum ZLP001

2.2 大豆低聚糖作為碳源對(duì)植物乳桿菌pH影響

不同濃度大豆低聚糖作為碳源對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵液pH影響趨勢(shì)則與OD600剛好相反（見(jiàn)圖2）。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，添加大豆低聚糖發(fā)酵液pH值均呈明顯下降趨勢(shì)，24 h時(shí)，添加不同濃度大豆低聚糖pH分別為5.00、4.32、4.30、4.43。沒(méi)有添加糖對(duì)照pH沒(méi)有表現(xiàn)明顯降低，反而到24 h時(shí)，其pH還略有升高。結(jié)果表明，植物乳桿菌可以利用培養(yǎng)基中大豆低聚糖產(chǎn)生酸性物質(zhì)，使得發(fā)酵液pH迅速降低。

圖2 不同濃度大豆低聚糖對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵液pH影響Fig.2 Effect of different level of soybean oligosaccharide on pH of fermentation broth of Lactobacillus plantarum ZLP001

2.3 大豆低聚糖對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵液乳酸濃度影響

大豆低聚糖作為碳源對(duì)于植物乳桿菌發(fā)酵液中乳酸生成量影響如圖3所示。

圖3 不同濃度大豆低聚糖對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵液乳酸生成量影響Fig.3 Effect of different level of soybean oligosaccharide on lactic acid production of Lactobacillus plantarumZLP001

隨著植物乳桿菌培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，添加大豆低聚糖發(fā)酵液中乳酸生成量明顯上升，24 h時(shí)，添加不同濃度大豆低聚糖（1%～7%）乳酸生成量分別為47.80、66.53、59.52、58.44 mmol· L-1。沒(méi)有添加糖對(duì)照組乳酸生成量只有小幅增加，到24 h時(shí)其乳酸含量?jī)H為7.79 mmol·L-1。結(jié)果說(shuō)明，植物乳桿菌正是發(fā)酵和利用大豆低聚糖產(chǎn)生乳酸等酸性物質(zhì)，從而使發(fā)酵液呈酸性環(huán)境。

2.4 大豆低聚糖作為碳源植物乳桿菌生長(zhǎng)曲線

植物乳桿菌在不同碳源條件下形成生長(zhǎng)曲線如圖4所示。

由圖4可見(jiàn)，在0～32 h內(nèi)，葡萄糖和大豆低聚糖添加可以明顯增加植物乳桿菌增殖速度，均可作為植物乳桿菌良好碳源。大豆低聚糖作為碳源相比于葡萄糖作為碳源，植物乳桿菌迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，適應(yīng)期短，且對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期較長(zhǎng)，至16 h進(jìn)入穩(wěn)定期，生長(zhǎng)后期OD值也略高于葡萄糖作為碳源。此外，兩種碳源在32 h時(shí)均未出現(xiàn)明顯衰亡表現(xiàn)，說(shuō)明穩(wěn)定期較長(zhǎng)。

圖4 植物乳桿菌生長(zhǎng)曲線（不同碳源）Fig.4 The growth curve of Lactobacillus plantarumZLP001(different carbon source)

2.5 大豆低聚糖作為碳源植物乳桿菌抑菌特性

本研究對(duì)大豆低聚糖作為碳源對(duì)植物乳桿菌抑菌特性進(jìn)行研究，并以葡萄糖作為碳源和不添加碳源作為比較（見(jiàn)表1）。結(jié)果表明，植物乳桿菌對(duì)大腸桿菌、金色葡萄球菌和沙門氏菌都有一定抑制作用，而且其抑菌效果主要表現(xiàn)在發(fā)酵液和上清液，菌泥不表現(xiàn)抑菌性。相比于沒(méi)有添加任何糖無(wú)糖培養(yǎng)基，葡萄糖和大豆低聚糖添加都能明顯增加植物乳桿菌抑菌性。而利用葡萄糖或大豆低聚糖作為植物乳桿菌碳源，對(duì)植物乳桿菌本身抑菌特性沒(méi)有明顯影響，只有葡萄糖為碳源發(fā)酵液對(duì)沙門氏菌抑菌性顯著高于大豆低聚糖作為碳源。

表1 大豆低聚糖作為碳源對(duì)植物乳桿菌抑菌特性研究（抑菌圈，mm）Table1 Effect of soybean oligosaccharide as carbon source on antibacterial characteristic of Lactobacillus plantarum ZLP001

3 討論

有關(guān)大豆低聚糖對(duì)乳酸桿菌選擇性利用報(bào)道較少，本研究針對(duì)大豆低聚糖對(duì)植物乳桿菌增殖和抑菌特性影響進(jìn)行體外研究。研究結(jié)果表明，大豆低聚糖添加對(duì)豬源植物乳桿菌ZLP001體外增殖有明顯促進(jìn)作用，可以顯著提高乳酸菌活菌數(shù)，降低發(fā)酵液pH。大豆低聚糖表現(xiàn)最佳效果添加比例為3%。

羅予等體外研究結(jié)果表明，按1%大豆低聚糖含量配制培養(yǎng)基，可明顯促進(jìn)腸道菌群中雙歧桿菌生長(zhǎng)，經(jīng)24 h培養(yǎng)，添加大豆低聚糖培養(yǎng)液其OD600nm值＞1.5，pH降到4.3[4]。本研究中當(dāng)大豆低聚糖添加比例達(dá)到7%時(shí)，活菌數(shù)較添加3%和5%時(shí)明顯下降，這說(shuō)明乳酸菌在培養(yǎng)過(guò)程中，代謝糖發(fā)酵后產(chǎn)生代謝產(chǎn)物過(guò)多，可能使細(xì)菌生長(zhǎng)產(chǎn)生自限性，因此碳源量過(guò)高反而會(huì)抑制菌生長(zhǎng)。這和郝林華等[6]利用低聚果糖體外增殖雙歧桿菌和李艷麗等[7]利用低聚木糖體外增殖乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌試驗(yàn)結(jié)果一致。此外，熊德鑫等[8]研究表明，低聚葡甘糖和低聚異麥芽糖對(duì)雙歧桿菌促生長(zhǎng)作用有明顯梯度效應(yīng)，隨著低聚糖添加比例增加（0.5%～2%），促生長(zhǎng)作用明顯增加。而李曉卉[9]研究低聚果糖和低聚異麥芽糖對(duì)雙歧桿菌和乳酸桿菌增殖作用則不呈現(xiàn)梯度效應(yīng)，0.2%～1%添加比例均無(wú)顯著差異。這和本試驗(yàn)結(jié)果有些不同，其原因有可能是寡糖種類和純度或不同乳桿菌菌種造成，也有可能是添加梯度比例設(shè)置不同造成。

乳酸是乳酸菌經(jīng)糖酵解途徑關(guān)鍵終產(chǎn)物之一，它能夠降低消化道pH，從而抑制病原菌生長(zhǎng)和繁殖[10]。本研究測(cè)定不同大豆低聚糖添加比例發(fā)酵24 h內(nèi)發(fā)酵液中乳酸生成量變化。由結(jié)果可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，發(fā)酵液中乳酸生成量不斷增加，這和Rycroft等[11]利用低聚果糖和龍膽低聚糖體外發(fā)酵以及張曉萍等[12]利用低聚木糖體外發(fā)酵青春雙歧桿菌生成乳酸趨勢(shì)是相同。此外，發(fā)酵液中乳酸濃度上升和pH下降存在著很強(qiáng)一致性，說(shuō)明pH下降確由乳酸等代謝產(chǎn)物生成引起。本研究中大豆低聚糖3%添加比例，其乳酸生成量要達(dá)到66.53 mmol· L-1。這要比Rycroft等[13]報(bào)道體外發(fā)酵大豆低聚糖（乳酸產(chǎn)量為18.90 mmol·L-1）所產(chǎn)生乳酸量高。其可能原因是研究所利用寡糖來(lái)源和有效成分含量以及不同菌種代謝能力和產(chǎn)酸能力不同造成。

大豆低聚糖作為碳源能夠有效促進(jìn)植物乳桿菌增殖，形成典型生長(zhǎng)曲線。本研究繪制大豆低聚糖添加比例為3%時(shí)植物乳桿菌生長(zhǎng)曲線，并與葡萄糖和不添加碳源對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比。相比于葡萄糖作為碳源，大豆低聚糖可使植物乳桿菌迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，且縮短適應(yīng)期，延長(zhǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，穩(wěn)定期OD值也略高于葡萄糖。吳大暢等[14]用殼寡糖取代MRS培養(yǎng)基中葡萄糖后，并不能有效促進(jìn)乳酸桿菌增殖，且不能形成典型生長(zhǎng)曲線。但當(dāng)以1 g·L-1殼寡糖比例加入正常MRS培養(yǎng)其中，卻可以明顯提高乳酸桿菌增殖速度，提前進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，縮短生長(zhǎng)適應(yīng)期，且對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期延長(zhǎng)。其研究結(jié)果表明，殼寡糖與葡萄糖協(xié)同作用更適于為乳酸桿菌生長(zhǎng)提供碳源。大豆低聚糖與葡萄糖是否對(duì)植物乳桿菌增殖有明顯協(xié)同作用還需進(jìn)行后續(xù)研究來(lái)證明。

植物乳桿菌可以分泌細(xì)菌素等抗菌物質(zhì)，從而體現(xiàn)一定抑菌特性[15]。本研究結(jié)果可以看出，利用葡萄糖和大豆低聚糖作為植物乳桿菌碳源，對(duì)植物乳桿菌本身抑菌特性影響沒(méi)有明顯差別。這有可能是因?yàn)槠咸烟呛痛蠖沟途厶潜恢参锶闂U菌利用代謝途徑（糖酵解途徑或磷酸戊糖途徑）和代謝產(chǎn)物（乳酸、乙酸和乙醇）相似，以使抑菌物質(zhì)組成和產(chǎn)生量差異不大適成。植物乳桿菌是兼性乳酸發(fā)酵菌，同時(shí)進(jìn)行同型乳酸發(fā)酵和異型乳酸發(fā)酵，這兩種代謝進(jìn)行程度和比例取決于菌種性質(zhì)和外界培養(yǎng)條件，從而影響其抑菌特性。這一點(diǎn)還需要進(jìn)行更進(jìn)一步研究和驗(yàn)證。另外，雖然研究表明大豆低聚糖本身可能具有一定抑菌作用[16-17]，但本試驗(yàn)中大豆低聚糖僅作為植物乳桿菌碳源，到發(fā)酵后期被利用已經(jīng)所剩無(wú)幾，因此對(duì)抑菌特性未表現(xiàn)明顯影響。

4 結(jié)論

大豆低聚糖對(duì)植物乳桿菌體外生長(zhǎng)具有顯著促進(jìn)作用。培養(yǎng)基中大豆低聚糖適宜添加比例為3%時(shí)表現(xiàn)最好增殖效果。大豆低聚糖作為植物乳桿菌碳源，和葡萄糖相比對(duì)植物乳桿菌本身抑菌特性沒(méi)有明顯影響。

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