平頂猴在HIV/AIDS動物模型中的應(yīng)用及研究進展

雷愛華，龐 偉，張高紅，鄭永唐,3,4,*

1. 中國科學(xué)院和云南省動物模型與人類疾病機理重點實驗室, 中國科學(xué)院昆明動物研究所, 云南 昆明 650223；

2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049；

3. 中國科學(xué)院昆明靈長類研究中心, 云南 昆明 650223；

4. 中國科學(xué)院昆明動物研究所-香港中文大學(xué)生物資源與疾病分子機理聯(lián)合實驗室, 云南 昆明 650223

非人靈長類(nonhuman primates, NHP)動物在組織結(jié)構(gòu)、免疫、生理和代謝等方面與人類非常相似，對于研究 HIV/AIDS傳播和致病機制以及抗AIDS藥物和疫苗具有不可替代的作用(Li et al,2007a; Zhang et al, 2007; Van Rompay, 2012; Zhu et al, 2010)。在NHP動物中，黑猩猩(chimpanzee, Pan troglodytes)和長臂猿(gibbon, Nomascus nasutus)能被HIV-1感染，但感染后不發(fā)??；且由于它們是瀕危珍貴動物，作為AIDS模型動物受到了極大限制。舊大陸猴(Old World monkey)中的獼猴(rhesus macaques, Macaca mulatta)和食蟹猴(cynomolgus macaques, Macaca fascicularis)均不能被 HIV-1感染，而能被猴免疫缺陷病毒 (simian immunodeficiency virus, SIV)和人/猴嵌合免疫缺陷病毒(simian-human immunodeficiency virus, SHIV)所感染，感染后會出現(xiàn)類似人AIDS癥狀。目前，SIV/SHIV獼猴模型是最常用的 AIDS動物模型(Ambrose et al, 2007)。然而，SIV/SHIV與HIV-1之間存在較大的遺傳差異，在評價藥物及疫苗有效性和安全性上存在局限性 (Ambrose et al, 2007; Van Rompay, 2012; Zhang et al, 2007)。因此，構(gòu)建合適的NHP動物模型仍然是HIV/AIDS研究中的熱點和難點。

平頂猴(pigtailed macaques)，又稱豚尾猴，是目前唯一報道可以被HIV-1感染的舊大陸猴(Agy et al,1992; Hu, 2005)，作為HIV/AIDS模型動物具有許多優(yōu)勢。本文綜述了平頂猴在HIV/AIDS動物模型上的研究進展及其相關(guān)分子機制，闡述了 SIV、HIV、SHIV和HSIV通過不同途徑感染平頂猴的特點，并結(jié)合我們實驗室的工作探討了平頂猴 AIDS模型的限制因素和前景。

1 平頂猴HIV/AIDS動物模型的優(yōu)點

猴科獼猴屬的平頂猴、獼猴 (包括印度獼猴和中國獼猴)和食蟹猴是目前 HIV/AIDS研究中應(yīng)用最為廣泛的 NHP動物(Baroncelli et al, 2008;Hatziioannou & Evans, 2012)。平頂猴在～500萬年前與獼猴和食蟹猴從進化上產(chǎn)生了分歧，而獼猴和食蟹猴之間則在 240萬年后才出現(xiàn)分歧(Baroncelli et al, 2008; Morales & Melnick, 1998)。2001 年動物分類學(xué)家將平頂猴中的3個亞種提升為3個不同的種：巽他平頂猴 (sunda pigtailed macaques, M.nemestrina)、北平頂猴 (northern pigtailed macaques,M. leonina)和明打威猴 (mentawai macaques, M.pagensis) (Groves, 2001; Gippoliti, 2001; Kuang et al,2009)。在地理分布上，巽他平頂猴(M. nemestrina)主要分布于馬來西亞半島南部、蘇門答臘及波羅洲；明打威猴 (M. pagensis)主要生活在明打威群島；北平頂猴 (M. leonina)主要棲息在我國云南西南部和西藏東南部以及緬甸、泰國、馬來半島和印度支那地區(qū)等地 (Rosenblum et al, 1997)。目前尚無這3種平頂猴對SIV/HIV病毒易感性是否存在差異的研究報道。迄今為止，幾乎所有SIV/HIV感染平頂猴模型的研究報道使用的平頂猴均為巽他平頂猴 (M. nemestrina)。

與獼猴和食蟹猴相比，平頂猴在HIV/AIDS動物模型方面具有許多優(yōu)勢。首先，在HIV-1性傳播模型方面，平頂猴體型較大，生殖道組織結(jié)構(gòu)及月經(jīng)周期與人很相似，全年均可繁殖，非常適合作為性傳播疾病模型動物 (Patton et al, 2009)。盡管食蟹猴全年可繁殖，但是其體型較小，陰道腔和子宮頸直徑也較小，給陰道鏡檢查和多次活檢帶來了很大的困難 (Patton et al, 2004)。獼猴的繁殖則具有明顯的季節(jié)性。目前，平頂猴在陰道毛滴蟲，沙眼衣原體等性傳播疾病方面的相應(yīng)模型已經(jīng)建立 (Patton et al, 2001; Patton et al, 2006)。鑒于其它性傳播疾病會增加HIV-1感染人的風(fēng)險，Henning et al (2011)首次成功建立了SHIVSF162P3、沙眼衣原體與陰道毛滴蟲的共感染平頂猴模型，臨床癥狀與人類似，為平頂猴在殺微生物劑等方面的應(yīng)用提供了技術(shù)支持。其次，在HIV-1靜脈傳播模型方面，由于病毒限制因子TRIM5α的存在，獼猴和食蟹猴對HIV-1感染存在一種進入后限制感染的現(xiàn)象 (Stremlau et al, 2004)。與獼猴和食蟹猴不同，平頂猴可被HIV-1感染 (Agy et al, 1992; Bosch et al, 2000)。我們實驗室首次發(fā)現(xiàn)平頂猴不表達限制 HIV-1復(fù)制的TRIM5α蛋白，而是形成TRIM5-CypA融合模式，且融合產(chǎn)物不限制HIV-1的復(fù)制，在細胞和分子水平上證實了北平頂猴是較理想的艾滋病模型動物(Cao et al, 2012; Kuang et al, 2009; Liao et al, 2007)。此外，近年來發(fā)現(xiàn)平頂猴對simian tropic (st) HIV-1和 HSIV-vif易感(Hatziioannou et al, 2009;Hatziioannou & Evans, 2012; Thippeshappa et al,2011)，預(yù)示平頂猴在HIV-1/AIDS動物模型的研究中具有較好前景。

2 HIV/AIDS平頂猴模型

當(dāng)前，靜脈吸毒和黏膜傳播 (同性傳播和異性傳播)是HIV-1傳播的兩種主要途徑。在感染途徑方面，Zhou et al (2013)發(fā)現(xiàn)通過血液途徑感染的HIV-1患者比通過黏膜途徑感染的患者具有更強的T細胞免疫應(yīng)答。然而，在猴AIDS模型上，一些研究發(fā)現(xiàn)靜脈和黏膜感染兩種途徑對于感染后病毒載量和CD4+T細胞的變化影響不大 (Batten et al,2006; Laurén et al, 2006)。同時也有研究發(fā)現(xiàn)HIV/SIV的接種途徑會影響病毒在體內(nèi)的遺傳變異及致病性 (Couedel-Courteille et al, 2003; Ambrose et al, 2001)。這也許與不同病毒感染不同非人靈長類動物有關(guān)。以下重點介紹SIV、HIV、SHIV和HSIV通過不同途徑感染平頂猴的特征及模型的應(yīng)用價值。

2.1 SIV感染平頂猴

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有～40種物種特異性(species specificity)的 SIV存在于不同的非洲猴中，在進化和來源上至少可以分為 SIVsm、SIVagm、SIVgsn、SIVcpz、SIVlhoest、SIVcol和 SIVmnd等 7 大支系(Klatt et al, 2012b)。SIV感染其自然宿主后，盡管宿主體內(nèi)的病毒載量較高但通常不發(fā)病(Hatziioannou &Evans, 2012; Klatt et al, 2012b)。SIV和HIV-2的基因組序列相似性為～80%，而與HIV-1的基因組序列相似性僅為45% (Baroncelli et al, 2008) ，SIV與HIV-1的基因結(jié)構(gòu)圖如圖1。由于SIV感染的獼猴出現(xiàn)腸系膜淋巴結(jié)處記憶CD4+T細胞減少和AIDS樣臨床癥狀 (Lackner & Veazey, 2007)，因而被大量用于AIDS研究。

圖1 不同免疫缺陷病毒的基因結(jié)構(gòu) (經(jīng)Elsevier許可，修改自Ambrose et al, 2007)Figure 1 Genome structure of various immunodeficiency viruses (Adapted from Ambrose et al, 2007 with permission from Elsevier)

早在1988年，科學(xué)家就發(fā)現(xiàn)從SIV感染的平頂猴淋巴結(jié)中分離出的SIVmne能感染平頂猴，感染的平頂猴出現(xiàn)腹瀉、貧血和消瘦等癥狀 (Benveniste et al, 1988)。迄今為止，研究者已利用多種SIV建立平頂猴感染模型。例如，SIVagm感染平頂猴能引起其CD4+T細胞數(shù)減少，最終出現(xiàn)猴AIDS癥狀(Goldstein et al, 2005)。同時，研究發(fā)現(xiàn)SIVsmm的變異株SIVsmmPBj14感染平頂猴后，在10～14 d內(nèi)平頂猴會出現(xiàn)CD4+T細胞數(shù)量快速下降、腹瀉和消瘦等致死性綜合征 (O'Neil et al, 1999)，而HIV-1感染者是在感染晚期由于免疫缺陷而出現(xiàn)各種 AIDS臨床癥狀。由于SIVsmmPBj14感染的平頂猴與人AIDS在發(fā)病時間和致病機制上不同，目前該模型研究較少。與SIVsmmPBj14不同，SIVsun和SIVlhoest靜脈感染平頂猴能使平頂猴的外周血和淋巴結(jié)處CD4+T細胞數(shù)下降，出現(xiàn)鳥分枝桿菌和卡氏肺囊蟲等機會性感染，但病毒載量與平頂猴的疾病進程無明顯關(guān)聯(lián)(Beer et al, 2005)，與人AIDS情況不太一致。有些研究者發(fā)現(xiàn)SIVmac感染平頂猴后，血漿中最高的病毒載量與HIV-1感染人的相當(dāng) (表1), 外周血CD4+T細胞逐漸下降，與人感染 HIV-1的情況很相似(Batten et al, 2006; Klatt et al, 2012a; Smith et al,2005)。Klatt et al (2012a) 在對 SIVmac239靜脈感染平頂猴動態(tài)過程的研究中發(fā)現(xiàn)，平頂猴比獼猴的疾病進程要快，平均分別為42.17周和69.56周，其原因可能是由于平頂猴感染SIV前的免疫活化水平高于獼猴，這與他們之前的研究結(jié)果較為一致 (Klatt et al,2010) 。而Mason et al (2008) 發(fā)現(xiàn)SIV感染前平頂猴中心記憶CD4+T細胞數(shù)的多少與SIVmac251感染平頂猴的疾病進程快慢有關(guān)，即感染前中心記憶CD4+T細胞數(shù)越少，感染后平頂猴的發(fā)病進程越快。此外，SIVmac感染平頂猴后疾病進程的快慢可能與平頂猴的自身免疫遺傳背景有關(guān)。例如，Smith et al (2005)研究發(fā)現(xiàn)平頂猴中MHC-I類分子Mane-A*10 (將SIV Gag KP9抗原肽呈遞給效應(yīng)T細胞)和獼猴中的Mamu-A*01一樣會抑制SIV在猴體內(nèi)的復(fù)制。這些結(jié)果均說明SIV感染平頂猴的疾病進程可能受多方面因素影響。

表1 HIV/AIDS平頂猴模型的主要特征Table 1 Main characteristics of HIV/AIDS infection in pigtailed macaques

總之，SIV感染的平頂猴發(fā)病癥狀較明顯，與人AIDS相似。SIVmac感染平頂猴模型現(xiàn)已被應(yīng)用于AIDS發(fā)病機制，藥物和疫苗等方面的研究。此外，有些SIVmac239感染平頂猴的疾病進程緩慢，類似 HIV-1感染者中的長期無進展者，可作為HIV-1/AIDS研究中的長期不進展模型 (Klatt et al,2012a)。不足的是，SIV與HIV-1間遺傳差異較大，不能真實反應(yīng)HIV-1蛋白在猴體內(nèi)的功能。例如，SIV不表達HIV-1的Vpu蛋白，從而限制了Vpu基因相關(guān)功能和靶標(biāo)的研究。同樣，SIV表達的Vpx蛋白在 HIV-1中不表達。由于序列的差異性，對HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶 (RT) 有抑制作用的非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTIs)對 SIVmacRT無抑制作用(Uberla et al, 1995)。此外，由于囊膜蛋白及抗原表位的差異，猴體內(nèi)對抗SIV復(fù)制的天然和獲得性免疫反應(yīng)(中和抗體，CTL反應(yīng))與HIV-1感染人所引起的免疫反應(yīng)不盡不同 (Ambrose et al, 2007)。因此，SIV感染模型用于AIDS研究具有局限性。

2.2 HIV感染平頂猴

在尋找建立HIV/AIDS動物模型的過程中，Agy et al (1992)首次在體外使用不同的HIV-1感染平頂猴、獼猴和食蟹猴等的外周血單個核細胞(PBMC)，發(fā)現(xiàn)僅平頂猴PBMC對 HIV-1易感；用 HIV-1LAI通過靜脈成功感染的2只平頂猴在感染后能持續(xù)檢測到 HIV-1抗體并且從分離的 PBMC中能培養(yǎng)出HIV-1LAI。但是，令人遺憾的是 HIV-1感染的平頂猴CD4+T細胞數(shù)基本不變，病毒載量很低且缺乏持續(xù)性，亦不表現(xiàn)猴AIDS癥狀 (表1)。為使HIV-1在平頂猴體內(nèi)持續(xù)復(fù)制，Agy et al (1997) 試圖通過HIV-1NL4-3和 HIV-1LAI在多只平頂猴體內(nèi)傳代以得到致病力更強的毒株，但未取得成功。Bosch et al(2000) 將HIV-1在新生平頂猴中傳代，結(jié)果HIV-1發(fā)生累積突變，毒力得到提高，但是猴CD4+T細胞數(shù)量無變化且病毒血癥仍缺乏持續(xù)性。在免疫應(yīng)答方面，Kent et al (1995)研究發(fā)現(xiàn)HIV-1感染平頂猴后4～8周就出現(xiàn)了針對 HIV-1 gag、env和nef蛋白的細胞毒T細胞效應(yīng)(CTL)并持續(xù)至140周。同時，他們得出 HIV-1特異的 T淋巴細胞反應(yīng)與HIV-1不能持續(xù)感染平頂猴有關(guān)(Kent et al, 1997)。這些研究結(jié)果說明細胞免疫對控制HIV-1在平頂猴中的復(fù)制發(fā)揮了重要作用。

與HIV-1感染平頂猴不同，HIV-2靜脈感染平頂猴后，CD4+T細胞數(shù)明顯下降且產(chǎn)生持續(xù)的病毒血癥并出現(xiàn)人AIDS癥狀 (表1)。強致病株HIV-2287靜脈感染的平頂猴CD4+T細胞數(shù)在2個月時開始下降，6～12個月就發(fā)展到AIDS期 (Kuller et al,2001)。相比之下，SIVsm感染的獼猴CD4+T細胞數(shù)下降通常發(fā)生在感染后4～12個月，發(fā)展到AIDS期則需要1～3 a (Hirsch & Johnson, 1994)。HIV-1感染者的CD4+T細胞數(shù)逐漸下降一般發(fā)生在感染后7～10 a，發(fā)展到AIDS期通常也在感染后7～10 a，而 HIV-2感染者的病程很緩慢(Staprans &Feinberg, 2004)。HIV-2287對平頂猴的致病力很強，可用于AIDS急性致病機理的研究。此外，Pullium et al (2001)采用HIV-2GB122分別通過靜脈和直腸感染平頂猴，平頂猴精漿中出現(xiàn)病毒的時間要比血液中出現(xiàn)病毒的時間晚 1～2周，且在病毒載量上低10倍。同時，與通過靜脈感染的平頂猴相比，通過直腸感染的平頂猴精液中病毒的持續(xù)時間較短。這對于 HIV-1靜脈和性傳播的預(yù)防研究具有重要意義。

綜上所述，迄今為止，研究建立的HIV-1感染平頂猴是一個急性過程，病毒血癥缺乏持續(xù)性，尚不能應(yīng)用于AIDS藥物和疫苗的研究。HIV-2感染平頂猴是目前HIV感染舊大陸猴中唯一出現(xiàn)AIDS樣癥狀的動物模型。由于HIV-2僅在西非局部地區(qū)流行，致病力較弱，因此對 HIV-2/AIDS動物模型的研究較少。平頂猴不表達TRIM5α限制因子可能是其對 HIV易感的一個重要原因 (Brennan et al,2007; Kuang et al, 2009; Liao et al, 2007)。盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)宿主的細胞免疫對于控制病毒復(fù)制發(fā)揮重要作用，但是在HIV-1感染平頂猴的后期，病毒是否轉(zhuǎn)為潛伏感染或是被宿主徹底清除仍有待進一步研究。

2.3 SHIV感染平頂猴

由于SIV感染獼猴模型在評價艾滋病疫苗和藥物的有效性方面存在較大局限性，因此，研究者采用分子克隆技術(shù)構(gòu)建了以SIVmac為骨架嵌合HIV-1 env、tat、rev和 vpu基因的 SIV-HIV 嵌合病毒Env-SHIV(Shibata et al, 1991) (圖1)。為了評價逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的有效性，Uberla et al (1995)構(gòu)建了嵌入HIV-1 RT的RT-SHIV，并成功感染獼猴。近年來，研究者通過將SHIV病毒在猴體內(nèi)多次傳代培養(yǎng)已經(jīng)得到了諸如 SHIV89.6P(X4型, env來自HIV-189.6)、SHIVKU-1(X4型，env來自 HIV-1IIIB)和SHIVSF162P3(R5型, env來自HIV-1SF162)等強致病株(Staprans & Feinberg, 2004)。SHIV病毒可以通過靜脈和黏膜兩種途徑感染平頂猴，感染猴出現(xiàn)CD4+T細胞數(shù)下降和腹瀉、消瘦等重要艾滋臨床指標(biāo) (表1)。SHIVSF162P3感染猴的疾病進程較緩慢，病毒載量與 HIV-1感染人的較為接近，因而被大量用于HIV/AIDS研究(Staprans & Feinberg, 2004)。Vishwanathan et al (2011)研究了反復(fù)低劑量SHIVSF162P3陰道途徑攻毒感染平頂猴與其月經(jīng)周期的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在黃體后期(孕酮水平很高且局部免疫水平較低)平頂猴對SHIV易感。Polacino et al (2008)將R5型的SHIVSF162P4采用靜脈和黏膜兩種途徑感染平頂猴和獼猴，發(fā)現(xiàn)平頂猴的病毒載量高于獼猴且病毒血癥持續(xù)時間較長，說明SHIV病毒對平頂猴更易感。此外，Shehu-Xhilaga et al (2007) 用SIVmac251靜脈感染和 SHIVmn229直腸感染平頂猴，發(fā)現(xiàn)在急性感染期后，平頂猴的睪丸和附睪組織均含有SIV和SHIV病毒。這對于研究HIV-1性傳播機制和HIV-1傳播的預(yù)防具有重要意義。Ambrose et al (2001)則用SHIV89.6通過陰道和靜脈兩種途徑感染平頂猴，發(fā)現(xiàn)通過陰道比通過靜脈感染的平頂猴的前病毒載量峰值和 CD4+細胞下降出現(xiàn)的時間要晚1周；在黏膜免疫應(yīng)答方面，陰道途徑感染的平頂猴黏膜CD8+T細胞反應(yīng)更快、黏膜抗SHIV抗體水平更高，而在系統(tǒng)免疫應(yīng)答方面無差別。這說明病毒通過陰道感染宿主時，宿主產(chǎn)生了更強的抗病毒免疫反應(yīng)。在 RT-SHIV感染平頂猴模型方面，Jiang et al (2009)研究發(fā)現(xiàn) RT-SHIV(RT來自HIV-1HXB2)對非核苷酸逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTIs)敏感且能夠通過陰道途徑感染平頂猴，可用于NNRTIs以及殺微生物劑和疫苗的研究。

總之，SHIV在基因序列上比 SIV更接近于HIV-1，在抗體研究和以囊膜蛋白為抗原的疫苗評價中具有明顯的優(yōu)勢 (Ambrose et al, 2007; Zhang et al, 2007)。因此，SHIV感染平頂猴模型在AIDS發(fā)病機制、疫苗和殺微生物劑研究等方面得到了廣泛應(yīng)用(Batten et al, 2006; Kent et al, 2005; Zhu et al,2010)。然而，SHIV是以SIV為骨架所構(gòu)建，在序列上與HIV-1存在較大差異。因此，SHIV感染平頂猴模型在研究AIDS發(fā)病機制及藥物和疫苗等方面仍然具有一定的局限性。最近，相關(guān)研究采用焦磷酸測序技術(shù)研究了平頂猴和正常女性陰道菌群的組成及含量，發(fā)現(xiàn)平頂猴的陰道菌群與正常女性的陰道菌群之間存在差異 (Spear et al, 2012)，這為陰道菌群如何影響SIV/SHIV通過陰道途徑感染平頂猴的研究打下了基礎(chǔ)。

圖2 抗HIV和SIV的限制因子和拮抗它們的病毒蛋白 (經(jīng)Elsevier許可，引自Blanco-Melo et al, 2012 )Figure 2 Restriction factors that target HIV and SIV and their vial antagonists(Cited from Blanco-Melo et al, 2012 with permission from Elsevier)

2.4 HSIV感染平頂猴

近年來，研究者采用分子生物學(xué)手段對 HIV-1和宿主的相互作用進行了深入研究，發(fā)現(xiàn)了一系列抗病毒的宿主限制因子, 如 TRIM5、APOBEC3及SAMHD1 等(圖 2)(Blanco-Melo et al, 2012)。其中，三模體蛋白 5α (tripartite motif protein 5α, TRIM5α)和 載 脂 蛋 白 B mRNA 編 輯 酶 3G 和 3F(apolipoprotein B mRNA-editing enzyme 3G and 3F,APOBEC3G/3F)是 3個主要的限制因子。獼猴TRIM5α 能識別HIV-1并與HIV-1衣殼蛋白相互作用，限制HIV-1在獼猴細胞中的復(fù)制 (Stremlau et al,2004)。APOBEC3G和APOBEC3F為胞嘧啶脫氨酶，在病毒逆轉(zhuǎn)錄時可以將其 cDNA的胞嘧啶(C)脫氨為尿嘧啶(U), 使前病毒發(fā)生超突變，抑制病毒的復(fù)制作用，而這一作用可被病毒的輔助蛋白Vif (virion infectivity factor)所拮抗且拮抗作用具有物種特異性(species-specificity)。HIV-1的 Vif蛋白能夠拮抗人的APOBEC3G/F，而不能拮抗猴的APOBEC3G/F(Chiu & Greene, 2008)。研究發(fā)現(xiàn)，APOBEC3H也能限制HIV-1的復(fù)制 (Albin & Harris, 2010)。在一些HIV-1感染者中，APOBEC3 mRNA的表達水平和HIV-1病毒載量或病毒發(fā)生超突變的百分比呈負相關(guān)，而與CD4+T細胞數(shù)正相關(guān) (Albin & Harris,2010)。例如，Ulenga et al (2008)發(fā)現(xiàn)在 APOBEC3G和APOBEC3F mRNA水平上，低調(diào)定點病毒載量的HIV-1感染者比高調(diào)定點病毒載量的感染者的表達量明顯要高。同時，Mussil et al (2011)發(fā)現(xiàn)SIV感染的獼猴中，病毒載量較低或長期不進展的獼猴體內(nèi)APOBEC3G和APOBEC3F mRNA表達量明顯升高。最近，Endsley & Ho (2012)發(fā)現(xiàn)HIV-2287感染平頂猴后，APOBEC3G-CD4、Vif-CD4及APOBEC3G-Vif間存在較強的相關(guān)性。

基于拮抗獼猴TRIM5α和APOBEC3蛋白限制病毒復(fù)制的作用及縮小SIV/SHIV與HIV-1之間的遺傳差異的雙重考慮，Hatziioannou et al (2006)以HIV-1為骨架將其表達衣殼蛋白(CA)的基因和 vif基因替換成 SIVmac的相應(yīng)基因構(gòu)建了 stHIV-1(simian-tropic HIV-1) (圖1)。他們發(fā)現(xiàn)stHIV-1在體外多次傳代后能在獼猴外周血淋巴細胞(PBL)中復(fù)制。Kamada et al (2006)則將HIV-1NL4-3的CA基因的一小段 (HIV-1 cyclophilin A結(jié)合位點)和vif基因替換成 SIVmac的相應(yīng)基因并經(jīng)體外傳代后得到HIVNL-DT5R。他們的體外結(jié)果顯示平頂猴 T淋巴細胞比獼猴T淋巴細胞對HIVNL-DT5R更易感。平頂猴感染HIVNL-DT5R后能產(chǎn)生針對HIV-1蛋白的抗體，但平頂猴感染后的CD4+T細胞數(shù)沒有下降，沒有出現(xiàn)AIDS病癥 (Igarash et al, 2007) (表1)。此外，Kuroishi et al (2009)在HIVNL-DT5R的基礎(chǔ)上將HIV-1衣殼蛋白的 α螺旋 6和 7之間的環(huán)序列替換成SIVmacL6/7 CA的序列提高了其在食蟹猴細胞上的復(fù)制能力。隨后，Saito et al (2011)采用基因工程方法構(gòu)建了HIV-1(MN4-5S)，發(fā)現(xiàn)其在食蟹猴體內(nèi)、外的復(fù)制能力強于 HIVNL-DT5R的復(fù)制能力，與HIVNL-DT5R感染平頂猴的能力相當(dāng) (Igarashi et al,2007)，而MN4-5S和HIVNL-DT5R均不能在獼猴細胞中復(fù)制。隨后，他們對stHIV-1的Gag-CA的序列區(qū)進行改造得到了一系列的 HIV-1mt (macaquetropic HIV-1), 體外實驗發(fā)現(xiàn)病毒 MN4Rh-3(Gag-CA 發(fā)生 Q110D 突變)在食蟹猴細胞中的復(fù)制能力得到提高但與TRIM5α蛋白的抗病毒作用無關(guān)，這說明猴體內(nèi)可能還存在其他蛋白與 Gag-CA蛋白相互作用影響病毒的復(fù)制水平(Nomaguchi et al，2013)。上述研究結(jié)果表明stHIV-1病毒對宿主的易感性受猴的免疫遺傳背景影響，stHIV-1對不同猴的易感性排序為：平頂猴＞食蟹猴＞獼猴。

由于平頂猴細胞不表達限制 HIV-1復(fù)制的TRIM5α蛋白，研究人員以HIV-1為骨架僅將HIV-1的 vif基因替換成SIV的vif基因構(gòu)建了 HSIV-vif毒株 (Hatziioannou et al, 2009; Thippeshappa et al,2011) (圖 1)。Hatziioannou et al (2009) 在 HIV-1NL4-3的基礎(chǔ)上構(gòu)建了stHIV-1SV(vif來自SIVmac239，env來自SHIV-KB9)、stHIV-12V(vif來自HIV-2ROD，env來自SHIV-KB9)和stHIV-1SCA+SV(在stHIV-1SV基礎(chǔ)上將CA的序列替換成SIVmac239的CA序列)，且它們在平頂猴細胞中均能很好地復(fù)制(圖3)。同時，他們將stHIV-1SV和stHIV-12V混合感染平頂猴后發(fā)現(xiàn)感染急性期的病毒載量水平與HIV-1感染者急性期的病毒載量水平相當(dāng)，且在感染后0.5 a內(nèi)均能在猴體內(nèi)檢測到病毒血癥 (表1)，而隨后由于CD8+T細胞或其他免疫細胞和分子的抗病毒作用，病毒在平頂猴體內(nèi)的復(fù)制受到了抑制。同時，采用雞尾酒療法對平頂猴進行感染前預(yù)防用藥(pre-exposure prophylaxis, PrEP)，發(fā)現(xiàn)PrEP可有效預(yù)防高劑量的stHIV-1sv/2v靜脈感染平頂猴。與之類似的是，Thippeshappa et al (2011) 在HIV-1NL4-3的基礎(chǔ)上只將 vif 替換成 SIVmne027的 vif得到 HSIV-vif,，通過靜脈感染平頂猴后，也出現(xiàn)持續(xù)的病毒血癥(＞1.5～2 a)和針對HIV-1的特異抗體反應(yīng)。Humes& Overbaugh (2011)在R5嗜性A亞型的HIVAQ23的基礎(chǔ)上將其 vif基因替換為 SIVmac239的 vif構(gòu)建了HIVAQ23/SIVvif病毒。HIVAQ23/SIVvif在平頂猴淋巴細胞中的復(fù)制能力較弱，但在體外傳代過程中g(shù)p120處發(fā)生了2個獨立的突變: G312V(V3環(huán))和A204E(C2區(qū))。這2個突變顯著提高了病毒gp120與平頂猴細胞CD4分子的相互作用，使得病毒復(fù)制水平明顯上升。這為提高含HIV-1A亞型基因的HSIV病毒在平頂猴細胞中的復(fù)制水平提供了有用線索。

圖 3 stHIV-1在平頂猴淋巴細胞上的復(fù)制 (引自Hatziioannou et al, 2009)Figure 3 Replication of stHIV-1 variants in pigtailed macaque lymphocytes in vitro (cited from Hatziioannou et al, 2009)

創(chuàng)建接近于人 AIDS的動物模型一直是 AIDS非人靈長類動物模型研究的方向，而HIV/AIDS動物模型能否用于HIV-1方面的研究取決于所用病毒與HIV-1在病毒傳播、致病性和變異性等方面的相似程度。與SHIV(含28%～30%的HIV-1序列)不同，stHIV-1或HSIV-vif涵蓋了≥90%的HIV-1序列，為針對HIV-1的藥物、疫苗和殺微生物劑的研究提供了很好的平臺。建立類似人AIDS癥狀的stHIV-1或HSIV感染平頂猴模型將是未來AIDS研究領(lǐng)域中的一個重要方向。目前，HSIV-vif感染平頂猴模型解決了HIV-1不能持續(xù)感染平頂猴的問題，但是感染后的平頂猴CD4+T細胞數(shù)沒有明顯變化，平頂猴不出現(xiàn)艾滋病癥。另外，當(dāng)前大部分流行HIV-1病毒是CCR5嗜性的(Staprans & Feinberg, 2004)，因此構(gòu)建R5型的HSIV-vif感染平頂猴模型具有重要的現(xiàn)實意義。Thippeshappa et al (2011) 的體外實驗結(jié)果表明R5型的HSIV-vif與X4型的HSIV-vif在平頂猴PBMC中的復(fù)制水平相當(dāng)。然而，HSIV-vif是否能通過黏膜途徑感染平頂猴，R5型的HSIV-vif是否能持續(xù)感染平頂猴等的問題有待進一步研究。2011年，研究者在髓系來源的單核細胞中發(fā)現(xiàn)了抗HIV-1限制因子 SAMHD1(sterile alpha motif and histidine/aspartic acid domain-containing protein 1)，其在活化的CD4+T細胞中不表達，而在表達CCR5受體的靜息CD4+T細胞、巨噬細胞以及樹突狀細胞中均有所表達 (Baldauf et al, 2012; Li PL et al,2012)。SAMHD1是一種 dGTP激活的三磷酸水解酶，通過降解HIV-1逆轉(zhuǎn)錄所需的dNTPs來抑制病毒的復(fù)制，且可被HIV-2和SIV編碼的Vpx蛋白所拮抗(Blanco-Melo et al, 2012)。Vpx蛋白在SIV有效感染平頂猴中發(fā)揮重要作用 (Belshan et al,2012)。猴和人的SAMHD1均能有效抑制HIV-1的復(fù)制水平。因此，R5型的stHIV-1或HSIV病毒在平頂猴體內(nèi)的復(fù)制會受到 SAMHD1的抑制。由此可見，為使 HSIV-vif感染的平頂猴發(fā)病進程與人AIDS相似，我們有必要對stHIV-1或HSIV-vif病毒在猴體內(nèi)進行傳代或進一步改造，如嵌入SIV的vpx基因、替換HIV-1的其他基因序列或?qū)Σ《举|(zhì)粒進行定點突變。

3 展 望

在過去的30 a中，HIV/AIDS靈長類動物模型在HIV-1的傳播和致病機制、臨床前AIDS疫苗的研發(fā)、藥物和殺微生物劑等的研究方面發(fā)揮了舉足輕重的作用。HAART治療能控制HIV-1復(fù)制，但是不能清除病毒潛伏庫。我們或許能在非人靈長類動物模型上找到根治HIV-1的方法或策略。但是病毒感染物種的特異性給構(gòu)建合適的AIDS動物模型帶來了極大的挑戰(zhàn)，缺少對HIV-1易感的動物模型仍然是制約人類對抗HIV/AIDS的一大瓶頸。在舊大陸猴中，平頂猴與獼猴和食蟹猴不同，能急性感染HIV-1且對某些SIV/SHIV更易感。盡管HSIV感染平頂猴后未出現(xiàn)艾滋癥狀，但HSIV能持續(xù)感染平頂猴，有望成為更合適的HIV/AIDS靜脈和性傳播動物模型。

近年來，平頂猴數(shù)量的不足及其遺傳背景資料的缺乏嚴(yán)重限制了其在病毒免疫學(xué)方面的研究和應(yīng)用。靈長類動物的某些MHC會影響病毒的免疫逃逸，某些 MHC的等位基因能夠顯著延緩 AIDS疾病的進展 (Baroncelli et al, 2008; Dai et al, 2008)。因此，系統(tǒng)研究平頂猴MHC的遺傳背景對于深入理解SIV/HIV感染平頂猴的致病機理及疫苗研究具有重要意義。中國科學(xué)院昆明動物研究所規(guī)模引進了北平頂猴 (M. leonina)并進行飼養(yǎng)繁育和種群擴大，將為我國科技自主創(chuàng)新、疾病防控和人類健康提供強有力的支撐。我們實驗室已經(jīng)建立了SIV/SHIV感染中國獼猴的AIDS動物模型并進行了相關(guān)機制研究 (Li et al, 2007b; Li SY et al, 2012; Ma et al, 2012; Xia et al, 2010; 2011)，積累了較豐富的經(jīng)驗。我們還對北平頂猴的血液學(xué)和血液生化學(xué)指標(biāo)參數(shù)進行了測定，為北平頂猴動物模型創(chuàng)建提供了重要的基礎(chǔ)生物學(xué)數(shù)據(jù)(Pang et al, 2013)。目前正在開展新型HIV/HSIV感染北平頂猴方面的工作，旨在進一步研究感染北平頂猴的特性及機制，為HIV/AIDS發(fā)病機制、藥物和疫苗研究提供更好的研究平臺。

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