前列腺素E1對腦梗死后神經(jīng)干細胞增殖和遷移的影響☆

吉章閣張素平凌莉黃惠鴻何銳王慕真鄧婉青吳文法

側(cè)腦室室管膜下區(qū)(subventricular zone，SVZ區(qū))和海馬齒狀回顆粒下層是成年哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)干細胞的兩個主要分布區(qū)域[1-3]。眾多研究表明，腦梗死可誘導(dǎo)以上兩個區(qū)域的內(nèi)源性神經(jīng)干細胞增殖，并向梗死灶遷移和分化，這可能有助于腦梗死后神經(jīng)功能的改善[4]。近來研究發(fā)現(xiàn)，前列腺素E1對局灶性腦缺血大鼠模型有神經(jīng)保護作用，但具體機制尚不清楚[5]，目前尚無前列腺素E1對腦卒中后神經(jīng)再生影響的報道。本研究觀察前列腺素E1對大鼠腦梗死后內(nèi)源性神經(jīng)干細胞增殖、遷移和神經(jīng)功能的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物分組和腦梗死模型制作成年雄性Sprague Dawley大鼠（廣東省醫(yī)用實驗動物中心提供，合格證號：0109973，0109552）隨機分為3組，前列腺素E1組、溶劑對照組和假手術(shù)組，每組12只。前列腺素E1組和溶劑對照組按Chen等[6]方法制作大鼠右側(cè)大腦中動脈皮層支閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型。假手術(shù)組只開顱暴露不結(jié)扎血管。

1.2 前列腺素E1靜脈注射及5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）腹腔注射 MCAO術(shù)后24 h起，前列腺素E1組經(jīng)尾靜脈注射前列腺素E1（北京泰德制藥，批號：2192S，10 μg·kg-1·d-1，溶于0.5mL生理鹽水），每天1次，連續(xù)6d；溶劑對照組尾靜脈注射等量等療程的生理鹽水；假手術(shù)組不予尾靜脈注射。處死前3 d起3組大鼠經(jīng)腹腔注射BrdU（50 mg/kg，Sigma），每天2次，連續(xù)3 d。

1.3 神經(jīng)功能評分 MCAO或假手術(shù)后7 d、14 d，各組大鼠采用Bederson評分系統(tǒng)[7]行神經(jīng)功能評分。

1.4 灌注、取材及制片術(shù)后7d、14d，3組大鼠行腹腔麻醉后經(jīng)升主動脈依次灌注4℃肝素化生理鹽水（250IU/mL）和4%多聚甲醛，然后開顱取腦。腦組織后固定6 h后置于梯度蔗糖溶液中脫水。恒溫冰凍切片機（LEICA CM1900，Germany）切片，片厚10μm。晾干后置于-80℃冰箱保存。

1.5 腦梗死體積測定各組大鼠的相對腦梗死體積按Swanson等方法[8]采用Hematein and Eosin(H＆E)染色法計算，以梗死體積占梗死對側(cè)大腦組織的相對百分比表示。

1.6 免疫熒光檢測切片復(fù)溫后，依次浸泡于37℃2 mol/L鹽酸30 min、室溫0.1 mol/L硼酸溶液（pH=8.5）10 min，0.01 mol/L PBS漂洗3次，血清封閉1 h后加一抗：小鼠抗大鼠BrdU(1:800，Sigma-Aldrich，USA)/山羊抗大鼠 doublecortin（DCX，1:200，Santa Cluz，USA），4 ℃孵育過夜。0.01 mol/L PBS洗滌3次后滴加二抗：驢抗小鼠Alexa Flour 596（1：300，Invitrogen，USA）/驢抗山羊Alexa Flour 488（1：200，Invitrogen，USA），室溫孵育1.5h后封片。熒光顯微鏡（Olympus BX51，Japan）采集圖像，用NIH Image 1.46 for Windows進行圖像分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS for Windows 17.0進行統(tǒng)計分析，等級資料用Mann-Whitney U非參數(shù)檢驗，計量資料用SNK法比較多組間兩兩差異性。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評分 MCAO術(shù)后7d、14d，前列腺素E1組與同時點溶劑對照組比較[中位數(shù)（25%，75%）表示]，分別為 1.5（1.0，2.0）、2.0（2.0，3.0）(U=37，P=0.032)；0.5（0，1.0）、1.0（1.0，2.0）(U=28，P=0.003)。

2.2 腦梗死體積測定 H＆E染色顯示，MCAO術(shù)后大鼠的腦梗死灶位于右側(cè)顳頂葉皮質(zhì)；術(shù)后各時間點，前列腺素E1組腦梗死體積與溶劑對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。假手術(shù)組未見腦梗死灶。

2.3 SVZ區(qū)及梗死灶周細胞增殖免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，MCAO或假手術(shù)后7 d、14 d，各組大鼠手術(shù)側(cè)及對側(cè)SVZ區(qū)均存在BrdU+標記的新增殖細胞，其中前列腺素E1組和溶劑對照組以梗死側(cè)SVZ區(qū)顯著，假手術(shù)組兩側(cè)無顯著差別。前列腺素E1組梗死側(cè)SVZ區(qū)及梗死灶周BrdU+細胞數(shù)均顯著高于同時點溶劑對照組及假手術(shù)組（表1，P＜0.05）。此外，前列腺素E1組和溶劑對照組梗死側(cè)SVZ區(qū)的細胞增殖在MCAO術(shù)后7d最顯著，14d時下降。

2.4 手術(shù)側(cè)SVZ區(qū)內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的增殖術(shù)后7d、14d，免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，前列腺素E1組梗死側(cè)SVZ區(qū)BrdU+/DCX+細胞數(shù)顯著高于同時點溶劑對照組及假手術(shù)組，溶劑對照組及假手術(shù)對照組手術(shù)同側(cè)SVZ區(qū)BrdU+/DCX+細胞數(shù)之間比較差異亦具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖1）。

2.5 內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的遷移 MCAO術(shù)后7d、14d，前列腺素E1組、溶劑對照組均可見較多的BrdU+/DCX+細胞自梗死側(cè)SVZ區(qū)前角沿胼胝體向梗死灶周皮層遷移，形態(tài)上呈現(xiàn)為“鏈狀”遷移流，其中大多數(shù)BrdU+/DCX+細胞表現(xiàn)為典型的遷移細胞形態(tài)，即呈細長的細胞核和雙極細胞體。而MCAO術(shù)后7d，前列腺素E1組與溶劑對照組比較，遷移流中BrdU+/DCX+細胞更多（圖1），BrdU+/DCX+細胞遷移距離更遠（圖2）。

圖1 前列腺素E1促進腦梗死后梗死同側(cè)SVZ區(qū)BrdU+/DCX+標記的神經(jīng)干細胞增殖和遷移。注：A、D為MCAO術(shù)后7d前列腺素E1組、溶劑對照組梗死同側(cè)SVZ區(qū)前角DCX+細胞，G、J為同時點兩組梗死同側(cè)SVZ區(qū)外側(cè)壁DCX+細胞；B、E為同時點兩組梗死同側(cè)SVZ區(qū)BrdU+細胞，H、K為同時點兩組梗死同側(cè)SVZ區(qū)外側(cè)壁BrdU+細胞；C、F為同時點兩組梗死同側(cè)SVZ區(qū)DCX+/BrdU+細胞；I、L為同時點兩組梗死同側(cè)SVZ區(qū)外側(cè)壁BrdU+/DCX+細胞。M為術(shù)后7d、14d前列腺素E1組、溶劑對照組和假手術(shù)組大鼠手術(shù)側(cè)SVZ區(qū)DCX+/BrdU+細胞數(shù)的誤差限直條圖，＃為前列腺素E1組與同時點溶劑對照組比較，均P＜0.05；※為前列腺素E1組與同時點假手術(shù)組比較，均P＜0.05。標尺為500μm。

表1 各組大鼠術(shù)后不同時點梗死灶周及手術(shù)側(cè)SVZ區(qū)BrdU+細胞數(shù)（±s）

表1 各組大鼠術(shù)后不同時點梗死灶周及手術(shù)側(cè)SVZ區(qū)BrdU+細胞數(shù)（±s）

注：1)MCAO或假手術(shù)后7d、14d，前列腺素E1組與同時點溶劑對照組比較，均P＜0.05；2)MCAO或假手術(shù)后7d、14d，前列腺素E1組與同時點假手術(shù)組比較，均P＜0.05。

分組前列腺素E1組溶劑對照組假手術(shù)組n 6 6 6梗死灶周SVZ區(qū)7d 349.7±9.21)2)203.5±12.2 53.8±8.4 14d 203.4±13.31)2)136.7±11.8 27.2±6.2 7d 380.3±14.31)2)251.3±9.5 50.3±5.4 14d 230.2±10.11)2)126.2±8.8 24.3±6.3

圖2 前列腺素E1促進腦梗死后梗死同側(cè)SVZ區(qū)BrdU+/DCX+標記的神經(jīng)干細胞呈鏈狀形態(tài)遷移。注：A、B、C分別為MCAO術(shù)后7d前列腺素E1組梗死同側(cè)SVZ區(qū)前角DCX+細胞、BrdU+細胞和BrdU+/DCX+細胞，呈鏈狀遷移形態(tài)。D、E、F分別為術(shù)后7d溶劑對照組梗死灶同側(cè)SVZ區(qū)前角DCX+細胞、BrdU+細胞、BrdU+/DCX+細胞。G為MCAO術(shù)后7d前列腺素E1組和溶劑對照組梗死同側(cè)SVZ區(qū)BrdU+/DCX+細胞遷移距離的誤差限直條圖，＃為MCAO術(shù)后7d前列腺素E1組與溶劑對照組比較，P＜0.05。標尺為250μm。

3 討論

前列腺素E1（prostaglandinum E1，PGE1）是前列腺素的一種亞型，具有舒張血管、抑制血小板聚集、穩(wěn)定細胞膜和抗炎作用，主要用于治療周圍血管疾病、腦缺血、心肌缺血和肝臟缺血等缺血性疾病[9]。前列腺素E1治療可抑制腦缺血大鼠腦皮層內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶-2和基質(zhì)金屬蛋白酶-3表達，具有神經(jīng)保護作用[10]；近來Sheng[9]等報道前列腺素E1治療可增加大鼠腦缺血后熱休克蛋白70、熱休克蛋白60和Bcl-2蛋白表達，拮抗神經(jīng)細胞凋亡，減少腦梗死體積，改善神經(jīng)功能缺損[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，MCAO術(shù)后7d、14d，前列腺素E1組較溶劑對照組神經(jīng)功能評分明顯降低，提示前列腺素E1可改善神經(jīng)功能缺損，對缺血性腦卒中具有神經(jīng)保護作用，與以上研究結(jié)論相符。而腦梗死體積兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與Sheng等[5]的研究結(jié)論不同，這可能與兩項研究前列腺素E1用藥起始時間和劑量差異有關(guān)。

近年來，受益于神經(jīng)干細胞分子標志物(DCX等)、DNA復(fù)制標志物(BrdU)等神經(jīng)再生檢測方法的創(chuàng)新[11]，眾多研究已證實腦卒中、腦外傷等中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷可誘導(dǎo)成年哺乳類動物腦內(nèi)神經(jīng)干細胞增殖，這可能對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷具有修復(fù)作用[12-13]，其中有線栓法誘導(dǎo)的大鼠腦梗死模型研究報道，MCAO術(shù)后7d在梗死同側(cè)SVZ區(qū)可見大量神經(jīng)干細胞增殖并沿胼胝體向梗死灶周遷移[14]。DCX是未成熟的神經(jīng)干細胞或成神經(jīng)細胞的標記物[1]，BrdU+/DCX+細胞則提示為新增殖的未成熟的神經(jīng)干細胞或成神經(jīng)細胞[1,15]。我們利用BrdU+/DCX+免疫熒光雙標檢測發(fā)現(xiàn)，在MCAO術(shù)后7d、14d，前列腺素E1組和溶劑對照組大鼠梗死灶周BrdU標記的新增殖細胞以及梗死側(cè)SVZ區(qū)BrdU+/DCX+標記的新增殖神經(jīng)干細胞均明顯多于假手術(shù)后的對照組，再次證明腦梗死能誘導(dǎo)SVZ區(qū)神經(jīng)干細胞增殖和梗死灶周細胞增殖；而前列腺素E1治療組SVZ區(qū)BrdU+/DCX+標記的新增殖神經(jīng)干細胞與同時點溶劑對照組相比亦明顯增多（圖1），提示前列腺素E1可促進腦梗死后SVZ區(qū)神經(jīng)干細胞增殖，這可能有助于腦卒中后神經(jīng)功能恢復(fù)。此外，在MCAO術(shù)后各時點，前列腺素E1組和溶劑對照組大鼠梗死側(cè)BrdU+/DCX+標記的新增殖神經(jīng)干細胞主要集中在梗死側(cè)SVZ區(qū)前角和側(cè)壁區(qū)域，提示SVZ區(qū)可能是腦梗死后內(nèi)源性神經(jīng)干細胞增殖并向梗死灶周遷移的起始地。形態(tài)學(xué)方面，我們發(fā)現(xiàn)前列腺素E1組和溶劑對照組梗死側(cè)SVZ區(qū)內(nèi)BrdU+/DCX+細胞首先向SVZ區(qū)前角部位集中，然后自前角呈鏈狀形態(tài)沿胼胝體向梗死灶周遷移，且越遠離SVZ區(qū)前角遷移流中的BrdU+/DCX+細胞越少（圖2）；而在MCAO術(shù)后7d，與溶劑對照組相比，前列腺素E1組鏈狀遷移流中BrdU+/DCX+細胞遷移距離更遠（圖2），這提示前列腺素E1治療可促進SVZ來源的神經(jīng)干細胞向梗死灶周遷移，可能有助于腦梗死后受損腦組織的神經(jīng)重塑和修復(fù)，進而改善受損的神經(jīng)功能。近來有研究報道在大鼠局灶性皮層腦梗死后1周，可見大量新生的、未成熟的神經(jīng)干細胞遷移至距離SVZ區(qū)1～4 mm不等的梗死灶周皮質(zhì)，提示新增殖的神經(jīng)母細胞可能自SVZ區(qū)跨越紋狀體遷移至皮質(zhì)損傷部位[16]，這與我們研究觀察到的神經(jīng)干細胞遷移形態(tài)相符。亦有研究報道，人類缺血性腦卒中后梗死灶周亦可見類似的長距離的神經(jīng)母細胞遷移[17]，但卒中后未成熟神經(jīng)母細胞遷移的具體分子機制尚不清楚[18]，近來有研究報道SDF-1α/CXCR4信號傳導(dǎo)通路可能在指導(dǎo)神經(jīng)干細胞遷移過程中發(fā)揮重要作用[1,4]。

總之，本研究結(jié)果提示，前列腺素E1治療促進大鼠腦皮質(zhì)梗死后SVZ區(qū)神經(jīng)干細胞的增殖和遷移，并改善缺血性腦卒中后神經(jīng)功能缺損，但其具體分子生物學(xué)機制還有待進一步研究。

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