碳納米管復(fù)合微球修飾L-色氨酸及其對(duì)LDL的吸附性能

盧月美 鞏前明 梁 吉 聶慶東

(1福州大學(xué)機(jī)械工程及自動(dòng)化學(xué)院，福州 350108)

(2清華大學(xué)機(jī)械工程系，北京 100084)

(3清華大學(xué)校醫(yī)院，北京 100084)

0 引 言

心腦血管疾病已成為目前威脅人類健康和生命的“頭號(hào)殺手”，而研究發(fā)現(xiàn)血漿中的低密度脂蛋白(LDL)水平與心腦血管疾病的發(fā)生率呈正相關(guān)[1-3]?；谖阶饔玫难汗嗔魇乾F(xiàn)今治療高LDL的理想選擇[4-5]。人血中的LDL在正常生理pH環(huán)境下是直徑為18～25 nm的球形顆粒體，表面既有正電荷富集區(qū)又有疏水區(qū)[6]，因此要想通過(guò)吸附劑與LDL之間的特異性作用選擇性吸附LDL，則吸附劑的孔結(jié)構(gòu)及表面性質(zhì)是關(guān)鍵。

目前國(guó)外研制并臨床應(yīng)用的LDL血液灌流吸附劑有日本Kaneka公司的Liposorber系列 (其中的吸附劑是以球形纖維素為載體，以硫酸右旋糖酐為配基)[7-8]及德國(guó)Fresenius公司的DALI系統(tǒng)(聚丙烯酸覆蓋的聚丙酰胺柱全血吸附劑)[9-10]。這些吸附劑是通過(guò)吸附劑表面的酸性基團(tuán)與LDL之間的靜電結(jié)合作用來(lái)吸附LDL，雖然它們對(duì)LDL有較好的吸附能力和良好的血液相容性，但存在價(jià)格昂貴的缺點(diǎn)[11]，給LDL血液灌流的人群帶來(lái)了很大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，難以在我國(guó)臨床上廣泛應(yīng)用。而國(guó)內(nèi)對(duì)LDL吸附劑的研究報(bào)道有南開(kāi)大學(xué)，重慶大學(xué)，華東理工大學(xué)，四川大學(xué)，上海海洋大學(xué)等課題組，他們或以酸性基團(tuán)為配基，制得負(fù)電型LDL吸附劑[11-20]；或以吲哚-3-乙酸、色氨酸、十二醇或膽固醇等為配基制得疏水型LDL吸附劑[21-25]；或既有負(fù)電性配基又有疏水性配基的雙親型LDL吸附劑[26-30]。這些吸附劑雖然對(duì)LDL的有一定的吸附能力，但均以現(xiàn)有的大孔樹(shù)脂為載體(多孔殼聚糖、葡聚糖、纖維素微球，大孔珠狀聚乙烯醇或聚丙烯酰胺微球等)，其孔結(jié)構(gòu)不是專門(mén)針對(duì)LDL的，且都仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段。因此有必要開(kāi)發(fā)一種孔結(jié)構(gòu)及表面性質(zhì)均適合LDL的專用LDL吸附劑。

多壁碳納米管(CNTs)具有發(fā)達(dá)的中、大孔和高的比表面積，研究表明其對(duì)中分子物質(zhì)不僅具有優(yōu)異的吸附能力，而且吸附速率快[31]。碳納米管作為生物醫(yī)學(xué)材料使用時(shí)，具有良好的血液相容性[32,33]。另外，碳納米管表面易于修飾，可以共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵的方式修飾各種基團(tuán)[34-39]，可以通過(guò)與LDL之間的特異性作用來(lái)選擇性吸附LDL。且隨著碳納米管制備和純化技術(shù)的成熟，宏觀量合成碳納米管已成為可能，碳納米管的應(yīng)用成本也越來(lái)越低。因此碳納米管有望成為良好的新型LDL血液灌流吸附劑載體材料。

L-色氨酸(L-Trp，C11H12N2O2)，含有吲哚基團(tuán)，具有疏水性，可以與LDL表面的疏水區(qū)域(未酯化膽固醇區(qū))之間的疏水作用來(lái)識(shí)別LDL。同時(shí)L-Trp還含有弱酸性的羧酸，修飾至復(fù)合微球后可同時(shí)改善復(fù)合微球的親水性；另外，L-Trp還含有活性氨基，這有利于與其它活性基團(tuán)的反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)與復(fù)合微球的連接。另L-Trp本身就是人和動(dòng)物生命活動(dòng)中8種必需氨基酸之一，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥，食品及飼料添加等領(lǐng)域，所以修飾L-Trp不會(huì)對(duì)人體造成不良的影響。因此L-Trp應(yīng)是LDL吸附劑良好的配基。

本文以具有良好球形度和一定強(qiáng)度的多孔碳納米管/活性炭(CNTs/AC)復(fù)合微球?yàn)檩d體，采用環(huán)氧氯丙烷偶聯(lián)法修飾L-Trp，制備出含有一定配基數(shù)量的CNTs/AC復(fù)合微球(L-CNTs/AC)，并進(jìn)行LDL吸附試驗(yàn)，以期得到具有良好吸附能力的LDL吸附劑。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要原材料

多壁碳納米管(CNTs，自制，化學(xué)氣相沉積法制備并混酸 (濃硫酸與濃硝酸)純化，外徑約為20～40 nm，內(nèi)徑～10 nm)；線型酚醛樹(shù)脂(化學(xué)純，中科院化學(xué)所)；六次甲基四胺(分析純，北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司)；十二烷基硫酸鈉(SDS)(化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；聚乙烯醇(PVA)(平均聚合度：1750，北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司)；苯磺酰氯(化學(xué)純，上海金山亭新化工試劑廠)；濃硫酸(95．0%～98．0%，分析純，北京化工廠)；濃硝酸(65．0%～68．0%，分析純，北京化工廠)；L-色氨酸(L-Trp，生化試劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；環(huán)氧氯丙烷(ECH，分析純，汕頭市西隴化工廠有限公司)；二甲基亞砜(DMSO)(分析純，北京現(xiàn)代東方精細(xì)化學(xué)品有限公司)；其它試劑均為市售分析純?cè)噭８週DL病人血清(清華大學(xué)校醫(yī)院提供)。

1.2 碳納米管/活性炭復(fù)合微球修飾L-色氨酸

首先采用懸浮聚合、炭化、活化的方法制備得到不同碳納米管加入量的碳納米管/活性炭(CNTs/AC)復(fù)合微球[40]。將不同加入量(占酚醛樹(shù)脂的質(zhì)量分?jǐn)?shù))的CNTs超聲分散在無(wú)水乙醇中(KS-900F超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波海曙科生超聲設(shè)備有限公司)，功率450 W，頻率20 kHZ，碳納米管分散時(shí)間為9 h)，然后將酚醛樹(shù)脂和六次甲基四胺 (占酚醛樹(shù)脂的20wt%)溶于碳納米管乙醇溶液中，制得均勻分散相。150 mL 0．3wt%SDS 及 1．89wt%PVA 的混合水溶液為連續(xù)相。將分散相在600～700 r·min-1機(jī)械攪拌作用下加入70℃的連續(xù)相中，攪拌混合液20 min后升溫至96℃恒溫?cái)嚢? h，酚醛樹(shù)脂在苯磺酰氯催化下完全固化。依次用去離子水、無(wú)水乙醇清洗，烘干后即獲得碳納米管/酚醛樹(shù)脂復(fù)合微球。將此微球在600℃下炭化、水蒸氣850℃下活化90 min制得CNTs/AC復(fù)合微球。

其次采用環(huán)氧氯丙烷偶聯(lián)法修飾L-Trp。(1)復(fù)合微球上引入羥基：將體積量是復(fù)合微球質(zhì)量40倍的濃硝酸于70℃水浴下浸泡氧化2 h，清洗烘干后備用；(2)環(huán)氧氯丙烷(ECH)活化復(fù)合微球，通過(guò)羥基引入環(huán)氧基團(tuán)(如圖1(a))：將0．100 g樣品與 20 mL DMSO，5 mL ECH，20 mL 1．4 mol·L-1的 NaOH 溶液混合均勻后于40℃下反應(yīng)2 h；(3)偶聯(lián)L-Trp(如圖1(b))：0．6 g L-Trp，5 mL 1．4 mol·L-1NaOH，20 mL 0．1 mol·L-1碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液超聲混勻后加入ECH活化的樣品，65℃下反應(yīng)15 h，生理鹽水、去離子水清洗至中性，60℃真空干燥24 h以上即得到修飾了L-Trp的CNTs/AC復(fù)合微球。

1.3 復(fù)合微球的表征

采用德國(guó)LEO-1530型熱場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察微球的形貌及EDS能譜定性分析微球的表面元素種類；采用美國(guó)Thermo Electron公司Sorptomatic 1990型分析儀在77 K下測(cè)定多孔微球的氮?dú)馕摳角€，由脫附曲線用Barrett-Joyner-Halen(BJH)模型得到多孔微球的孔結(jié)構(gòu)。采用美國(guó)PerkinElmer公司Spectrum Gx型傅立葉紅外拉曼光譜儀 (分辨率：4 cm-1)、美國(guó) TA Instruments公司Q5000IR型熱重分析儀、美國(guó)PERKING-ELMER Physics Electronics公司的PHI5300型X射線光電子能譜表征復(fù)合微球的L-色氨酸的修飾效果。

采用北京瑞利分析儀器廠的UV9100型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定L-色氨酸的濃度，制得L-色氨酸濃度-吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線 (相關(guān)系數(shù)R2為0．999 6)，而后得到 L-Trp 濃度 c(μg·mL-1)與吸光度 A 的關(guān)系為：

而后根據(jù)578 nm處測(cè)得的吸光度值，由式(1)計(jì)算得到不同碳納米管加入量的復(fù)合微球所修飾的L-Trp 的濃度 c(μg·mL-1)。

1.4 復(fù)合微球?qū)DL的吸附實(shí)驗(yàn)

采用體外靜態(tài)吸附法進(jìn)行LDL吸附實(shí)驗(yàn)。將0．04 g不同CNTs加入量的L-CNTs/AC復(fù)合微球在生理鹽水中充分浸泡24 h，然后吸干水分，加入1．0 mL左右的高LDL血清，于37℃下恒溫振蕩2 h。用日本7170型全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定吸附前、后血清中的LDL含量，吸附效果用吸附量(AQ(mg·g-1))來(lái)表征，其計(jì)算方法如式(2)。

式中，c0—吸附前血清中LDL-C的濃度 (mmol·L-1)；

ct—吸附后血清中 LDL-C 的濃度(mmol·L-1)；

圖1 CNTs/AC復(fù)合微球的環(huán)氧氯丙烷活化(a)及偶聯(lián)L-Trp(b)Fig．1 Activation by epichlorohydrin(a)and coupling with L-Trp(b)of CNTs/ACcomposite beads

V—靜態(tài)吸附中所加的血清量(mL)；

W—靜態(tài)吸附中所用吸附劑的質(zhì)量(g)。

2 結(jié)果與討論

2.1 復(fù)合微球的孔結(jié)構(gòu)

以酚醛樹(shù)脂為粘結(jié)劑的懸浮聚合法、炭化及活化法可制得球形度良好，粒徑合適、強(qiáng)度適中的CNTs加入量高達(dá)45wt%的CNTs/AC復(fù)合微球，如圖2(a)所示。

由圖2(b)復(fù)合微球的孔徑分布圖可見(jiàn)，未加CNTs的酚醛基活性炭微球，中、大孔孔容極??；隨著CNTs加入量的增加，中、大孔的孔容增大，尤其是20～100 nm的孔容顯著增多。CNTs本身的堆積孔是復(fù)合微球中直徑為20～100 nm孔形成的主要原因，如圖2(c)所示。

圖2 CNTs/AC復(fù)合微球的宏觀形貌(a)孔徑分布(b)及復(fù)合微球中CNTs形成的堆積孔(c)Fig．2 Morphology(a)pore size distribution(b)and aggregated pores of CNTs(c)of CNTs/ACcomposite beads

2.2 復(fù)合微球修飾的L-色氨酸

在修飾了L-Trp的復(fù)合微球微觀形貌照片中可以看到復(fù)合微球的表面出現(xiàn)了針狀物質(zhì) (如圖3(a)所示)，通過(guò)X射線能譜(圖3(b))發(fā)現(xiàn)在復(fù)合微球表面上不僅含有較明顯的氧元素，而且出現(xiàn)了氯元素，這應(yīng)是ECH活化復(fù)合微球后在復(fù)合微球上存在的未偶聯(lián)L-Trp的環(huán)氧基團(tuán)。

圖4為復(fù)合微球修飾L-Trp前后的傅立葉紅外光譜圖，修飾了L-Trp之后，由硝酸氧化得到羥基的吸收峰變?nèi)趿?，這是因?yàn)榱u基在ECH活化環(huán)節(jié)被環(huán)氧基活化了。而在3 434 cm-1處出現(xiàn)了一個(gè)較弱的吸收峰，這可能是引入環(huán)氧基團(tuán)后的N-H伸縮振動(dòng)峰。1 571 cm-1是石墨烯C的紅外基頻模，出現(xiàn)了明顯的藍(lán)移。1 698 cm-1處的吸收峰可能為N-酰化氨基酸的-C=O和羧酸中的羰基疊加峰[41]；1 200 cm-1是C-O的伸縮振動(dòng)；而742 cm-1為色氨酸的苯環(huán)鄰位雙取代峰[42]。這說(shuō)明了復(fù)合微球表面修飾有LTrp。

從圖5可以看出，修飾了L-Trp之后，300℃之后的失重比濃硝酸氧化態(tài)的復(fù)合微球有了明顯的增大，這是因?yàn)?00℃之后修飾上的L-Trp上的基團(tuán)也參與了熱分解造成的。

由復(fù)合微球的XPS全譜圖(圖6(a))可見(jiàn)，在修飾L-Trp之前，復(fù)合微球中沒(méi)有氮(N)元素，偶聯(lián)L-Trp后出現(xiàn)了明顯的氮元素，且氧(O)元素的含量也增多。由XPS作表面元素半定量分析表明，修飾了LTrp的復(fù)合微球中表面元素nN/nC比為2．1/100。

圖3 40wt%CNTs/AC復(fù)合微球修飾L-Trp后的微觀形貌(a)及能譜圖(b)Fig.3 Morphology(a)and energy spectra(b)of 40wt%L-CNTs/ACcomposite beads

圖4 30wt%CNTs/AC復(fù)合微球修飾L-Trp前后的傅立葉紅外光譜Fig.4 Fourier transform infrared spectroscopy of 30wt%CNTs/ACcomposite beads

圖5 30wt%CNTs/AC復(fù)合微球修飾L-Trp前后的熱失重曲線Fig.5 Thermogravimetric curves of 30wt%CNTs/AC composite beads

將修飾了L-Trp的樣品各元素的XPS窄譜進(jìn)行計(jì)算機(jī)擬合分析，其中C1s的XPS峰可分解為：284．7，285．2，286．9 eV 及 288．0 eV(圖 6(b))，分別歸屬于C-C，C-H，C-N，-COOH基團(tuán)的C1s峰。由于修飾了L-Trp，使得C-C峰的比例僅有34.83%(如表1所示)，C-H鍵的比例占多數(shù)，達(dá)58.41%。O1s的結(jié)合能為 532.5，533.0 eV(圖 6(c))，分別是復(fù)合微球表面的C-OH和/或C-O-C基氧；N1s在400.4 eV(圖6(d))的峰值是由于σ*(N-H)響應(yīng)，而在406.3 eV處是由于σ*(N-C)的響應(yīng)[43-44]。這些都表明了L-Trp已成功地偶聯(lián)到復(fù)合微球上。

隨著對(duì)復(fù)合微球的修飾處理 (活化-氧化-修飾基團(tuán))，復(fù)合微球的晶化程度(R值)也在不斷變化。30wt%CNTs/AC復(fù)合微球活化態(tài)的R值為2.378，氧化態(tài)的R值增大為2.467，而修飾了L-Trp之后，R值增大到2.473，這表明了復(fù)合微球的表面修飾(氧化處理、修飾L-Trp)會(huì)使復(fù)合微球的缺陷增多(R值增大)。這是因?yàn)檠趸幚碓趶?fù)合微球表面引入了含氧官能團(tuán)，修飾L-Trp的處理過(guò)程則引入了吲哚基團(tuán)和羧基等，這些異質(zhì)原子的引入使微球的缺陷增多，晶化程度下降，這樣復(fù)合微球的表面活性增強(qiáng)，有利于吸附的進(jìn)行[45]。

修飾處理不僅改變了復(fù)合微球的表面性質(zhì)，而且對(duì)復(fù)合微球的強(qiáng)度也產(chǎn)生了一定的影響。由表2可見(jiàn)，修飾會(huì)使復(fù)合微球的強(qiáng)度受到損失，氧化處理使強(qiáng)度降低較嚴(yán)重，但修飾L-Trp的過(guò)程不會(huì)明顯降低強(qiáng)度?？傊砻嫘揎椫髲?fù)合微球的強(qiáng)度是未修飾前的約50%，仍能滿足血液灌流的要求(＞5N)。

2.3 L-CNTs/AC復(fù)合微球?qū)DL的吸附性能

從圖7中可以看出，L-CNTs/AC復(fù)合微球?qū)DL的吸附量隨著CNTs加入量的增加而不斷增大。當(dāng)CNTs加入量達(dá)45wt%時(shí)(本文所制備復(fù)合微球的最高 CNTs加入量)，LDL 吸附量達(dá) 4.623 mg·g-1，是未添加碳納米管的2.3倍多，且LDL吸附能力還有隨CNTs加入量增多而增大的趨勢(shì)。

圖6 修飾L-Trp的30wt%CNTs/AC復(fù)合微球的XPS全譜圖(a)C1s(b)O1s(c)及N1s(d)Fig．6 Survey spectrum(a)C1s(b)O1s(c)and N1s(d)of 30wt%L-CNTs/ACcomposite beads by X-ray photoelectron spectroscopy

表1 修飾L-Trp的30wt%CNTs/AC復(fù)合微球碳峰的XPS半定量分析Table 1 XPSsemi-quantitative analysis about Carbon peaks of 30wt%L-CNTs/AC composite beads

表2 修飾處理對(duì)CNTs/AC復(fù)合微球抗壓強(qiáng)度的影響Table 2 Effect of modification on the compressive strength of the CNTs/AC composite beads

L-CNTs/AC復(fù)合微球是依靠所修飾的L-Trp上的吲哚基團(tuán)與LDL表面層的未酯化膽固醇區(qū)之間的疏水作用來(lái)識(shí)別并吸附LDL的，因此復(fù)合微球上配基的數(shù)量對(duì)復(fù)合微球吸附LDL來(lái)說(shuō)是至關(guān)重要的。另外，由于LDL是一種大分子(18～25 nm的球形顆粒體)，所以復(fù)合微球內(nèi)部大中孔(20～100 nm)的孔容也是復(fù)合微球?qū)DL吸附能力的關(guān)鍵因素。

CNTs加入量的增多有利于復(fù)合微球上所能修飾上的配基-L-Trp修飾量的增大，當(dāng)CNTs加入量為 0、10wt%、30wt%、40wt%、45wt%時(shí)， 所能修飾上L-Trp 的量分別為 4．8、4．9、5．1、5．6、6．0 μg·mL-1。 這是因?yàn)榛焖崽幚淼腃NTs表面缺陷多，表面具有易于修飾。由于配基修飾量增大，復(fù)合微球的親水性得到了明顯改善 (修飾L-Trp后復(fù)合微球可充分浸泡于血清中，而修飾L-Trp前復(fù)合微球則是漂浮于血清之上)，這有利于復(fù)合微球與LDL分子的充分接觸，有利于增強(qiáng)與LDL之間的疏水作用力的發(fā)揮，對(duì)LDL吸附能力增強(qiáng)。另外，隨著CNTs加入量的增加(＞20wt%)，復(fù)合微球中適合吸附LDL的孔容(20～100 nm)增多(如圖 2(b)所示)。因此，此時(shí)復(fù)合微球?qū)DL的吸附能力顯著增強(qiáng)。

總之，CNTs在復(fù)合微球吸附LDL的過(guò)程中起到了兩個(gè)方面的重要作用 (如圖8所示)，一方面CNTs本身形成的堆積孔促進(jìn)復(fù)合微球中20～100 nm孔的形成，這些中大孔在復(fù)合微球中互相連通，構(gòu)建了通暢的LDL擴(kuò)散通道，從而進(jìn)一步促進(jìn)LDL吸附過(guò)程的進(jìn)行；另一方面CNTs又可作為配基的載體，促進(jìn)L-Trp配基修飾量的增多，L-Trp上的吲哚基團(tuán)通過(guò)疏水作用特異性吸附血清中LDL，從而促進(jìn)LDL在CNTs堆積孔間的吸附。

表3 修飾配基對(duì)40wt%CNTs/AC復(fù)合微球孔結(jié)構(gòu)的影響Table 3 Effect of modification on the pores structure of 40wt%CNTs/AC composite beads

圖7 不同CNTs加入量的修飾了L-Trp的復(fù)合微球?qū)DL的吸附量Fig．7 LDL adsorption amount on L-CNTs/ACcomposited beads with different CNTs mass ratio

圖8 CNTs在吸附LDL過(guò)程中所起作用示意圖Fig．8 Role of CNTs in the process of LDL adsorption

但當(dāng)CNTs加入量達(dá)40wt%以上時(shí)，LDL吸附量增長(zhǎng)緩慢，這與修飾配基后復(fù)合微球孔結(jié)構(gòu)發(fā)生變化有關(guān)：由于修飾處理不同程度地引入了異質(zhì)原子，這些異質(zhì)原子會(huì)占據(jù)原有孔腔的部分位置，從而使復(fù)合微球的各孔孔容均有所降低 (如圖9所示)。40wt%L-CNTs/AC復(fù)合微球，L-Trp修飾量為5．6 μg·mL-1， 其中 20～100 nm 的孔容為 0．244 cm3·g-1，僅為活化態(tài)時(shí)的40%(如表3所示)。所以使LCNTs/AC復(fù)合微球在吸附LDL時(shí)的有效孔容減少。

因此CNTs含量高時(shí)，雖然一方面修飾的配基密度增大，促進(jìn)LDL吸附量的增加，但另一方面由于配基占據(jù)了一定的孔隙位置，使得有效孔容增長(zhǎng)幅度降低，從而使得LDL的吸附量增長(zhǎng)減緩。但總的趨勢(shì)仍是L-CNTs/AC復(fù)合微球?qū)DL的吸附能力隨著CNTs加入量的增大而增強(qiáng)。

圖9 修飾處理對(duì)40wt%CNTs/AC復(fù)合微球孔結(jié)構(gòu)的影響Fig．9 Effect of modification on the pores structure of 40wt%CNTs/ACcomposite beads

3 結(jié) 論

(1)環(huán)氧氯丙烷偶聯(lián)法可將L-Trp修飾至CNTs/AC復(fù)合微球上。

(2)CNTs/AC復(fù)合微球中CNTs加入量越多，對(duì)LDL的吸附能力越強(qiáng)；當(dāng)CNTs加入量為45wt%時(shí)，LDL吸附量達(dá)4．623 mg·g-1，是未添加碳納米管的2．3倍多。因此修飾了L-Trp的碳納米管基復(fù)合微球在作為血液灌流LDL吸附劑方面有較好的應(yīng)用前景。

(3)CNTs在復(fù)合微球吸附LDL的過(guò)程中起到了重要的作用，一方面由于本身的堆積孔促進(jìn)了復(fù)合微球內(nèi)中大孔的形成，構(gòu)建了通暢的LDL擴(kuò)散通道；另一方面促進(jìn)了配基在復(fù)合微球表面修飾量的增多，增強(qiáng)了復(fù)合微球與LDL之間的作用。

(4)在今后的研究中還需進(jìn)一步考察此復(fù)合材料對(duì)高密度脂蛋白及血液相容性的影響。

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