5-氮雜胞苷對結(jié)腸癌細胞CHD5基因表達及細胞增殖活性的影響

趙 蕊，嚴啟滔，呂靜野，黃海麗，馬文麗

(南方醫(yī)科大學基因工程研究所，廣東廣州510515)

結(jié)腸癌在我國的發(fā)病率近年來有逐年增高的趨勢，其死亡率也成為僅次于肺癌和肝癌，占我國惡性腫瘤的第3位。越來越多的文獻報道了結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的各個階段都有特異性分子的參與，并且將這些特異性分子作為臨床治療的靶標，如S-腺苷甲硫胺酸可以使C-MYC啟動子區(qū)恢復(fù)甲基化水平，從而可以作為結(jié)腸癌治療的抗癌藥物等［1］。在前期的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)染色質(zhì)解旋酶DNA結(jié)合蛋白5(CHD5)基因能抑制結(jié)腸癌細胞增殖，并且利用RNAi方法成功干擾CHD5的表達后，提高了結(jié)腸癌細胞的增殖，因此CHD5可能是結(jié)腸癌的一個腫瘤候選抑制基因，但其腫瘤抑制機制還不清楚［2］。本研究分析了5-氮雜-2-脫氧胞苷(5-Aza-2-deoxycytidine)對CHD5在2株結(jié)腸癌細胞中的甲基化及其mRNA表達的影響，為揭示CHD5在結(jié)腸癌中發(fā)病的分子機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

293、Lovo、SW480 細胞和大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)DH5α為本實驗室保存;DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒、基因組DNA提取試劑盒、EpiTect Bisulfite試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Quanti-Tect Rev.Transcription kit)、qPCR(SYBR 法)(Qiagen公司);Premix Ex TaqTMHot Start Version、PCR產(chǎn)物克隆載體pMD18-T Vector(TaKaRa公司);10%胎牛血清(杭州四季青公司);DMEM培養(yǎng)液中(Gibco公司);AZA(Sigma);Trizol(Invitrogen)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng):293、Lovo、SW480按常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中。實驗時取處于對數(shù)生長期的細胞，其活細胞數(shù)達95%～100%。

1.2.2 Bisulfite Sequencing PCR(BSP)檢測結(jié)腸癌細胞中CHD5的甲基化水平:提取2株結(jié)腸癌細胞(Lovo和SW480)的基因組DNA，按照EpiTect Bisulfite試劑盒說明書用亞硫酸氫鈉修飾處理基因組DNA，DNA經(jīng)亞硫酸鹽處理后，設(shè)計BSP引物擴增目的片段。BSP引物分別為:5'-TTTAGGGGTTTG TATGGGTTTTAG-3'，5'-CCCTCTCCAAAAAAAATTA AAAAA-3'，反應(yīng)條件為94℃ ×5 min;94℃ ×30 s，55℃ ×30 s，72℃ ×30 s，40 個循環(huán);72℃ ×10 min，擴增片段長度為201 bp。將擴增獲得的PCR產(chǎn)物純化后與pMD18-T載體進行連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α。每個細胞系至少挑取10個單克隆進行酶切鑒定和測序鑒定，并用BiQ Analyzer軟件對甲基化狀況進行分析。

1.2.3 實時熒光定量 PCR(qPCR)檢測結(jié)腸癌細胞中CHD5 mRNA的表達:用 Trizol試劑抽提細胞總RNA，按QuantiTect Rev.Transcription Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書和qPCR(SYBR法)說明書分別進行反轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量PCR反應(yīng)。qPCR引物分別為:5'-TCCGCAAGCAGGTCAACTACA-3'，5'-CTCA TCCTCAGAGCCAATGGAA-3';反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性30 s;95℃ 5 s，60℃退火34 s，共40個循環(huán)。每個實驗重復(fù)3次取平均值。

1.2.4 5-Aza-2-deoxycytidine(AZA)體外誘導結(jié)腸癌細胞系去甲基化:將Lovo和SW480細胞接種于75 mL培養(yǎng)瓶中過夜，向培養(yǎng)基中加入AZA至終濃度5 μmol/L，每24 h更換1次培養(yǎng)基，連續(xù)處理72 h后用Trizol提取總RNA，檢測CHD5在mRNA水平上的表達，并用BSP方法分析其甲基化狀況。每個實驗重復(fù)3次取平均值。

1.2.5 MTT(［3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide］)檢測:取對數(shù)生長期的細胞1×106/L接種于3塊96孔培養(yǎng)板，過夜貼壁后加入5 μmol/L AZA每孔200 μL，每組設(shè)6個復(fù)孔，并設(shè)不加藥的對照組。試劑和培養(yǎng)液每24 h更換1次，每天取出1板，加入20 μL MTT(5 g/L)，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h后，直接加入Formazan溶解液溶解formazan在酶標儀上測定570 nm波長處的吸光度值。

1.3 統(tǒng)計學分析

應(yīng)用SPSS 13.0軟件，雙側(cè)檢驗法進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果

2.1 熒光定量PCR檢測5-氮雜胞苷對CHD5 mRNA基因在結(jié)腸癌細胞中表達的影響

Lovo和SW480細胞中CHD5基因的轉(zhuǎn)錄在5-氮雜胞苷處理后明顯增強，且呈時間依賴性(圖1)。

2.2 5-氮雜胞苷對結(jié)腸癌細胞CHD5啟動子區(qū)的甲基化水平的影響

BSP獲得的特異性擴增片段與預(yù)期的大小一致(圖2)。對篩選出的pMD18T-BSP陽性克隆質(zhì)粒，進行酶切鑒定(EcoRⅠ/HindⅢ)和測序鑒定。部分酶切結(jié)果如圖3顯示，目的片段與預(yù)期大小一致。

2個結(jié)腸癌細胞系Lovo、SW480中CHD5基因啟動子區(qū)的甲基化狀況在AZA處理72 h后明顯降低(圖4)，Lovo和SW480細胞的甲基化水平分別降低了52.9%和42.9%，因此，AZA體外誘導結(jié)腸癌細胞系后，Lovo和SW480細胞發(fā)生了明顯的去甲基化。

2.3 5-氮雜胞苷對結(jié)腸癌細胞增殖的影響

與AZA處理前相比，5 μmol/L AZA處理后的結(jié)腸癌細胞Lovo和SW480增殖受到了明顯的抑制(圖5)。

3 討論

圖5 5-氮雜胞苷處理后對結(jié)腸癌細胞增殖的影響Fig 5 The effect of AZA on proliferation

隨著表觀遺傳學研究的深入，越來越多的報道證實了腫瘤的發(fā)病機制與抑癌基因的異常甲基化相關(guān)。結(jié)腸癌是常見的惡性腫瘤，其發(fā)病機制與多種基因的異常表達相關(guān)，啟動子區(qū)的異常甲基化是導致抑癌基因失活的一個最常見的原因，目前已有相關(guān)文獻報道，結(jié)腸癌中多個抑癌基因由于啟動子區(qū)的甲基化導致失活的，如P16在結(jié)腸癌細胞系中存在著異常甲基化［3］。有大量文獻報道在各腫瘤中存在著CHD5基因的缺失，如神經(jīng)母細胞瘤［4］、腦膜瘤［5］等，并且在神經(jīng)腫瘤、乳腺癌［6-9］中 CHD5 啟動子區(qū)發(fā)生了超甲基化。那么表觀遺傳學失活可能是CHD5在腫瘤中失去活性的主要原因。通過前期的研究證實了CHD5基因是結(jié)腸癌的一個腫瘤候選抑制基因［2］，為了更進一步的研究其在結(jié)腸癌中的生物學行為，本研究選用甲基化抑制劑5-氮雜胞苷作用于結(jié)腸癌細胞，5-氮雜胞苷做為甲基化抑制劑，其通過與DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶共價結(jié)合［10］，達到CpG島去甲基化，使CHD5重新表達，降低酶的生物活性，從而起到抑制甲基化效應(yīng)，恢復(fù)基因轉(zhuǎn)錄水平的作用。結(jié)合5-氮雜胞苷處理前后CHD5基因表達的改變，可以推測啟動子區(qū)異常甲基化是結(jié)腸癌細胞CHD5基因失活的主要原因之一。5-氮雜胞苷通過反轉(zhuǎn)CHD5基因甲基化狀態(tài)，恢復(fù)CHD5基因表達。當然這也并不能排除還存在其他的原因?qū)е铝薈HD5基因的缺失，這還需要進一步的證實。經(jīng)過5-氮雜胞苷處理后，結(jié)腸癌細胞的增殖活性降低，表明細胞的惡性程度受到了一定的抑制，并且具有隨時間延長而增強的趨勢。此研究可以為結(jié)腸癌的治療提供一個新方法，為去甲基化治療腫瘤提供了又一個可靠的例證。

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