胡桃醌通過(guò)降低AKT活性抑制肺癌A549細(xì)胞增殖

劉元銀，雷淑慧，楊 燕，蔣幼凡*

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶400010;2.銅梁縣人民醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)科，重慶402560;3.攀枝花市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科，四川攀枝花617067)

肽酰脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶(peptidyl-prolyl cis/trans isomerase，PIN1)是目前已知調(diào)節(jié)磷酸化絲氨酸/蘇氨酸基序順?lè)礃?gòu)象變化唯一的酶［1］，在多種腫瘤組織中都呈現(xiàn)過(guò)表達(dá)［2］。胡桃醌是PIN1的天然抑制劑。有研究發(fā)現(xiàn)胡桃醌可以促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡，同時(shí)可以減少裸鼠皮下肺癌移植瘤的形成［3］，但有關(guān)胡桃醌抑制肺癌的分子機(jī)制研究甚少。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 B(serine/threonine protein kinase B)PKB，即AKT是腫瘤增殖信號(hào)通路中的一個(gè)重要節(jié)點(diǎn)［4］。本實(shí)驗(yàn)將探討PIN1抑制劑胡桃醌對(duì)AKT的影響及其在肺癌A549細(xì)胞增殖中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

人肺腺癌A549細(xì)胞(重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)研究室);胡桃醌(Juglone，Sigma公司)，純度98%;RNA提取試劑盒(百泰克公司);RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、real-time PCR試劑盒(TaKaRa公司);PIN1、AKT及AKT-pS473兔單克隆抗體(Epitomics公司);MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(碧云天公司);Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(貝博公司)。

1.2 方法

1.2.1 藥物配制:用二甲基亞砜(DMSO)將胡桃醌配制成終濃度為2 mmol/L的工作液，DMSO終濃度控制在0.1%以下，4℃避光下保存，使用時(shí)用不含血清的新鮮1640培養(yǎng)液倍比稀釋成所需濃度。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng):用含10%胎牛血清的新鮮1640培養(yǎng)液培養(yǎng)A549細(xì)胞，隔天換液1次，每3～5天傳代1次。

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞，按1×107個(gè)/L的濃度分別接種到96孔培養(yǎng)板上，分別加入含有終濃度為 0、6.25、12.5、25 和50 μmol/L胡桃醌，同時(shí)設(shè)無(wú)細(xì)胞空白對(duì)照，培養(yǎng)24和48 h，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3遍，按MTT試劑盒步驟進(jìn)行檢測(cè)，并按照下面公式計(jì)算不同濃度胡桃醌對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制:細(xì)胞抑制率(%)=(1－實(shí)驗(yàn)組平均A值/正常對(duì)照組平均A值)×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)A549細(xì)胞凋亡率:將A549細(xì)胞以5×104個(gè)/孔接種于6孔板，培養(yǎng)12 h后加入不同濃度胡桃醌，48 h后收集細(xì)胞，按 Annexin V-FITC/PI試劑盒步驟操作，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)A549細(xì)胞周期:按參考文獻(xiàn)［5］方法進(jìn)行。

1.2.6 Real-time PCR法檢測(cè)PIN1及AKT的mRNA表達(dá):按參考文獻(xiàn)［2］方法進(jìn)行，PCR引物如下:PIN1上游;5'-AGGACTTTGAGTCTCTGGCCTCAC-3';下游5'-AGGCGTCTTCAAATGGCTTCTG-3';AKT上游5'-CTTTCCAGACCCACGACC-3';下游5'-CTCCG AGTGCAGGTAGTCC-3';GAPDH上游5'-TGATTCTA CCCACGGCAAGTT-3';下游 5'-TGATGGGTTTCCCA TTGATGA-3'。

1.2.7 Western blot法檢測(cè)PIN1、AKT及AKT-pS473蛋白的表達(dá):按參考文獻(xiàn)［6］方法進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 胡桃醌對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

經(jīng)不同濃度的胡桃醌處理24和48 h后，細(xì)胞增殖均被顯著抑制。胡桃醌處理組間均有顯著差異(P＜0.05)，抑制作用呈濃度依賴(lài)性增加(r=0.927)(表1)。

2.2 胡桃醌對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

不同濃度胡桃醌組A549細(xì)胞凋亡較對(duì)照組顯著升高(P＜0.05)，并以晚期凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞為主。高濃度處理組較低濃度處理組凋亡率更高，不同濃度胡桃醌處理組間均有差異(P＜0.05)(圖1，表2)。

2.3 胡桃醌對(duì)A549細(xì)胞周期的影響

胡桃醌能濃度依賴(lài)的降低A549細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞的比例，升高G2/M期和S期細(xì)胞比例，造成A549細(xì)胞在G2/M期和S期的阻滯(表2)。

2.4 胡桃醌對(duì)PIN1、AKT mRNA的表達(dá)影響

各胡桃醌處理組PIN1 mRNA的表達(dá)較對(duì)照組顯著降低(P＜0.05)。其高濃度處理組較低濃度處理組表達(dá)更低，不同濃度胡桃醌處理組間均有差異(P＜0.05)(表3)。25 μmol/L胡桃醌處理細(xì)胞48 h比24 h的PIN1 mRNA表達(dá)更低(P＜0.05)(表4)。

2.5 胡桃醌對(duì)A549細(xì)胞PIN1、AKT、AKT-pS473蛋白表達(dá)的影響

不同濃度胡桃醌組中PIN1、AKT-pS473的蛋白表達(dá)較對(duì)照顯著降低(P＜0.05)，其高濃度處理組較低濃度處理組表達(dá)更低，不同濃度胡桃醌組間均有差異(P ＜0.05)(圖 2，表3)。25 μmol/L胡桃醌處理48 h細(xì)胞中 PIN1、AKT-pS473的蛋白表達(dá)較24 h時(shí)更低(P ＜0.05)(圖3，表4)。

表1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制情況Table 1 The inhibitory rate against cells growth measured by MTT assay(±s，A Value，n=4)

表1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制情況Table 1 The inhibitory rate against cells growth measured by MTT assay(±s，A Value，n=4)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 compared with control group;#P ＜0.05 compared with lower juglone concentration group．

group 24 hours IR 48 hours IR 63.67%control 0.625±0.052 － 0.960±0.069 －6.25 μmol/L Juglone 0.587 ±0.034* 6.34% 0.882 ±0.057* 8.09%12.5 μmol/L Juglone 0.492 ±0.016*# 21.24% 0.699 ±0.045*# 27.14%25 μmol/L Juglone 0.341 ±0.008*# 45.40% 0.423 ±0.024*# 55.9%50 μmol/L Juglone 0.274 ±0.005＊＊# 56.14% 0.335±0.015＊＊#

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)A549細(xì)胞凋亡Fig 1 The apoptosis rate of A549 cells detected by flow cytometry

表2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)A549細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期變化Table 2 The cell apoptosis rate and cell cycle of A549 detected by Flow cytometry(±s，%，n=3)

表2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)A549細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期變化Table 2 The cell apoptosis rate and cell cycle of A549 detected by Flow cytometry(±s，%，n=3)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 compared with control group;#P ＜0.05 compared with lower juglone concentration group．

/M control 4.20±0.20 71.35±5.37 18.78±1.14 9.8 group apoptosis rate G0/G1 S G2 54.23±2.21 27.88±1.23 17.89±1.54 7±0.96 6.25 μmol/L Juglone 8.70±0.40* 65.23±4.56 23.54±1.47 11.23±1.05 12.5 μmol/L Juglone 27.40±1.20*# 57.89±3.04 26.13±1.12 15.98±1.24 25 μmol/L Juglone 56.40±3.80*# 55.48±3.45 27.09±1.83 17.43±1.25 50 μmol/L Juglone 65.50 ±4.60＊＊#

表3 不同濃度胡桃醌處理組A549細(xì)胞中mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)Table 3 Relative mRNA and protein expression in A549 cells treated by different concentration of Juglone(±s，n=5)

表3 不同濃度胡桃醌處理組A549細(xì)胞中mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)Table 3 Relative mRNA and protein expression in A549 cells treated by different concentration of Juglone(±s，n=5)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 compared with control group;#P ＜0.05 compared with lower juglone concentration group．

046 0.516±0.011 0.626±0.015 6.25 μmol/L Juglone 0.807±0.050* 0.995±0.061 1.032±0.056* 0.522±0.019 0.554±0.023*12.5 μmol/L Juglone 0.708±0.067*# 1.003±0.080 0.892±0.024*# 0.522±0.020 0.464±0.018*#25 μmol/L Juglone 0.521±0.040*# 0.998±0.072 0.596±0.023*# 0.516±0.015 0.362±0.015*#50 μmol/L Juglone 0.282±0.020＊＊# 0.999±0.050 0.396±0.021＊＊# 0.514±0.018 0.228±0.020＊＊#mRNA PIN1 AKT AKT-pS473 control 1.002±0.01 1.000±0.009 1.280±0.group PIN1 mRNA AKT

表4 不同時(shí)間胡桃醌(25 μmol/L)處理組A549細(xì)胞中mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)Table 4 Relative mRNA and protein expression in A549 cells treated by Juglone for different time(±s，n=5)

表4 不同時(shí)間胡桃醌(25 μmol/L)處理組A549細(xì)胞中mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)Table 4 Relative mRNA and protein expression in A549 cells treated by Juglone for different time(±s，n=5)

＊P ＜0.05 compared with the group treated by 25 μmol/L juglone for 24 hours．

mRNA PIN1 AKT AKT-pS473 24 hours 0.712±0.057 0.999±0.080 0.764±0.03 group PIN1 mRNA AKT 2 0.512±0.031 0.436±0.023 48 hours 0.521±0.042* 0.998±0.071 0.575±0.036* 0.514±0.023 0.338±0.014*

3 討論

胡桃醌是PIN1的天然抑制劑，它對(duì)肺癌、乳腺癌、肝癌、大腸癌等多種腫瘤細(xì)胞均表現(xiàn)出較好的抗癌活性。胡桃醌對(duì)肺癌細(xì)胞具有明顯的生長(zhǎng)抑制作用，阻止細(xì)胞周期進(jìn)程，誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究中均表現(xiàn)出抗癌活性［7－8］。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)胡桃醌可劑量依賴(lài)性的抑制A549細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，將細(xì)胞周期阻滯在G2/M和S期，從而發(fā)揮抑癌效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)還進(jìn)一步研究了胡桃醌對(duì)AKT的影響，發(fā)現(xiàn)胡桃醌對(duì)AKT mRNA及AKT蛋白的表達(dá)影響不大，但對(duì)磷酸化AKT的表達(dá)呈現(xiàn)出顯著抑制作用，呈濃度依賴(lài)性，且胡桃醌處理48 h對(duì)磷酸化AKT的抑制作用較24 h時(shí)強(qiáng)。這可能是胡桃醌發(fā)揮抑制肺癌的機(jī)制之一，推測(cè)胡桃醌對(duì)AKT的影響發(fā)揮于翻譯后環(huán)節(jié)。

PIN1是細(xì)胞分裂中所必需的，可特異性催化已磷酸化的絲氨酸/蘇氨酸-脯氨?；虬l(fā)生順/反異構(gòu)，從而促進(jìn)人體細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化及轉(zhuǎn)化［9－10］。PIN1專(zhuān)一性調(diào)節(jié)構(gòu)型轉(zhuǎn)變是新發(fā)現(xiàn)的蛋白磷酸化后調(diào)節(jié)機(jī)制。AKT是腫瘤增殖信號(hào)通路PI3K/AKT中的一個(gè)重要節(jié)點(diǎn)分子，抑制AKT活性可以抑制腫瘤生長(zhǎng)。AKT的完全激活需要蘇氨酸Thr-308位點(diǎn)和C末端的絲氨酸Ser-473、酪氨酸Tyr-474位點(diǎn)的磷酸化，磷酸化的絲氨酸Ser-473能較好的反映AKT的活性度［4］。AKT含有絲氨酸/蘇氨酸基序，磷酸化的AKT可被PIN1調(diào)節(jié)順?lè)礃?gòu)象從而增加磷酸化AKT的穩(wěn)定性及活性［4］。PIN1的蛋白磷酸化后調(diào)節(jié)作用可能是PIN1抑制劑胡桃醌僅抑制磷酸化AKT表達(dá)而不減少AKT mRNA及AKT表達(dá)的原因。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示通過(guò)抑制PIN1表達(dá)從而調(diào)節(jié)AKT的活性可能是胡桃醌發(fā)揮抑制肺癌作用的分子機(jī)制。這為胡桃醌成為新型化療藥物提供理論基礎(chǔ)，為進(jìn)一步研究PIN1作為肺癌治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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