三磷酸腺苷二鈉氯化鈉注射液的質(zhì)量控制及安全性研究＊

陳琴華，李 鵬，朱 軍

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院藥學(xué)部·藥物分析與篩選研究所，湖北 十堰 442008)

三磷酸腺苷(ATP)是一種具有多種重要生理活性的輔酶，參與蛋白質(zhì)、脂肪、糖、磷脂及核酸的合成與代謝，適用于因細(xì)胞損傷后細(xì)胞酶功能減退引起的疾病，臨床上主要用于心律失常、心力衰竭、心肌炎的治療[1]，以及腦出血后遺癥和肝炎疾病的輔助治療[2－3]。目前市場(chǎng)上供注射用的ATP劑型為水針和粉針，海南新隆藥業(yè)有限公司聯(lián)合江西科倫藥業(yè)有限公司解決了ATP不穩(wěn)定的工藝難題[4]，首次研究申報(bào)了大容量氯化鈉注射液，減少了藥物配液交叉污染的機(jī)會(huì)，提高了該藥的臨床應(yīng)用水平。現(xiàn)對(duì)ATP氯化鈉注射液的質(zhì)量可控性和制劑安全性進(jìn)行了探討，報(bào)道如下。

1 試驗(yàn)材料

高效液相色譜儀，包括SPD－10A檢測(cè)器、LC－10AT泵(日本島津公司);pHs－25型酸度計(jì)。ATP對(duì)照品(含量大于99.5%);ATP氯化鈉注射液(規(guī)格為 100 mL∶20 mg，批號(hào)為050601，050602，050603，江西科倫藥業(yè)有限公司);甲醇(色譜純)，其他試劑(分析純)。豚鼠，雄性，體重250～350 g;家兔，雌雄不限，體重2.0～2.5 kg;均由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK遼2003－2009。

2 方法與結(jié)果

2.1 質(zhì)量控制

2.1.1 總核苷酸測(cè)定

精密量取本品5mL，置50mL容量瓶中，加0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(取磷酸氫二鈉35.8 g，加水至1 000mL，無(wú)水磷酸二氫鉀13.6 g，加水至 1 000mL，調(diào)節(jié) pH 至 7.0)至刻度，振搖使混勻。以上述緩沖液為空白溶液，照分光光度法測(cè)定，在259 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，按ATP的百分吸收系數(shù)為279，計(jì)算總核苷酸含量。

2.1.2 ATP 的重量比

色譜柱為 Kromasil C18柱(250 mm ×4.6 mm，5μm)，流動(dòng)相為0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(磷酸氫二鈉35.8 g，磷酸二氫鉀13.6 g，加水900mL溶解，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為7.0，加入四丁基溴化銨 1.61 g，加水至 1000mL)－甲醇(95∶5)，柱溫35℃，流速為1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為259 nm。在此色譜條件下理論板數(shù)按ATP峰計(jì)算應(yīng)大于2 000，各色譜峰的分離度應(yīng)大于1.5。按出峰次序依次記錄一磷酸腺苷、二磷酸腺苷和三磷酸腺苷的峰面積，高效液相色譜分析見(jiàn)圖1。參照2010年版《中國(guó)藥典(二部)》[5]方法計(jì)算ATP的重量比。ATP含量(%)=[總核苷酸×ATP的重量比(%)]/標(biāo)示量，有關(guān)物質(zhì)(%)=1－ATP的重量比(%)。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備

紫外分光光度法:精密稱(chēng)取ATP對(duì)照品20 mg，置100mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度。精密吸取 0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mL分別置10 mL容量瓶中，加0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，照分光光度法測(cè)定。結(jié)果表明，ATP質(zhì)量濃度在12～28μg/mL范圍內(nèi)與吸光度具有良好的線(xiàn)性關(guān)系，回歸方程為Y=0.032 2X －0.033 5，r=0.999 4(n=5)。

圖1 ATP氯化鈉注射液高效液相色譜圖

高效液相色譜法:精密稱(chēng)取ATP對(duì)照品20mg，置10mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度。精密吸取 0.2，0.6，1.0，1.4，1.8mL，分別置10mL容量瓶中，加水稀釋至刻度。分別吸取20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明，ATP質(zhì)量濃度在0.04～0.36 g/L范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線(xiàn)性關(guān)系，回歸方程為 Y=2×107X+2×104，r=0.999 6(n=5)。

2.1.4 回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取16，20，24mg的ATP對(duì)照品各3份，分別加入處方量輔料，置100mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，依法測(cè)定。結(jié)果總核苷酸和ATP的重量比回收率(n=3)分別為 99.1%，100.8% 和 99.3% 。

2.1.5 精密度和穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份ATP氯化鈉注射液，依法測(cè)定6次，測(cè)定總核苷酸和ATP重量比。結(jié)果含量和 RSD分別為102.8%和0.85%。于0，2，4，6，8，12 h 時(shí)依法測(cè)定同一份樣品，結(jié)果表明樣品在 12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取ATP氯化鈉注射液6份，依法測(cè)定總核苷酸和ATP重量比。結(jié)果含量和 RSD分別為102.8%和1.15%。

2.1.7 含量測(cè)定和有關(guān)物質(zhì)

取本品3批樣品，測(cè)定總核苷酸和ATP重量比，計(jì)算有關(guān)物質(zhì)和標(biāo)示含量。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 樣品有關(guān)物質(zhì)和含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

2.2 安全性試驗(yàn)

2.2.1 過(guò)敏性試驗(yàn)

取健康豚鼠18只，體重250～350 g，隨機(jī)平均分成3組，分別為生理鹽水組、陽(yáng)性對(duì)照組(10%雞蛋清，生理鹽水與雞蛋清9∶1混合即成)和ATP氯化鈉注射液組，各組每只動(dòng)物隔日腹腔注射受試藥物0.5mL，共3次。首次注射后的第14天和第21天，各組分別取3只豚鼠，每只分別給予對(duì)應(yīng)的受試藥物1.0mL進(jìn)行攻擊，觀(guān)察過(guò)敏反應(yīng)現(xiàn)象。陽(yáng)性對(duì)照組豚鼠在注射后共有5只出現(xiàn)呼吸困難、噴嚏、干嘔、咳嗽等過(guò)敏反應(yīng)，給藥組及陰性對(duì)照組兩次攻擊后均未見(jiàn)異常表現(xiàn)，結(jié)果均為陰性。

2.2.2 體外溶血試驗(yàn)

取兔血，離心、洗滌后，制備體積分?jǐn)?shù)為2%的紅細(xì)胞混懸液。取試管7支，分別加入2.5 mL紅細(xì)胞混懸液，其中兩支分別加入2.5mL蒸餾水和生理鹽水，作為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，其他5 只試管中依次加入 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5mL 的 ATP 氯化鈉注射液，各試管分別補(bǔ)加生理鹽水至5 mL，搖勻，置37℃水浴保溫，連續(xù)觀(guān)察4 h。陽(yáng)性對(duì)照管加入蒸餾水后，立即出現(xiàn)溶血現(xiàn)象;各供試藥液管及陰性對(duì)照管未發(fā)生溶血現(xiàn)象，紅細(xì)胞逐漸沉于管底，經(jīng)振搖后可均勻散開(kāi)，說(shuō)明亦無(wú)紅細(xì)胞凝聚現(xiàn)象。

2.2.3 血管刺激性試驗(yàn)

取家兔8只，分2組，每組4只，分別于耳緣靜脈滴注ATP氯化鈉注射液和0.9%氯化鈉注射液，滴注量均為4mL/kg，滴速為1.0mL/min，每天1次，連續(xù)3 d，給藥期間每日觀(guān)察血管注射部位及整個(gè)外耳廓有無(wú)變化。于第3次給藥后24 h將動(dòng)物處死，取給藥處血管及周邊組織，以5%甲醛溶液固定、切片、染色，切片部位為進(jìn)針部位向心端1 cm及2 cm處。給藥組、0.9%氯化鈉注射液對(duì)照組血管均未見(jiàn)異常病理改變，耳緣靜脈內(nèi)無(wú)血栓形成，血管內(nèi)皮細(xì)胞及周?chē)M織未見(jiàn)水腫、炎性浸潤(rùn)或壞死等異常改變。

3 討論

含量和有關(guān)物質(zhì)是衡量藥物有效性和內(nèi)在品質(zhì)最重要的指標(biāo)，一般來(lái)說(shuō)，越接近標(biāo)示含量，有關(guān)物質(zhì)越少，則藥物的品質(zhì)越高。ATP化學(xué)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，高溫和長(zhǎng)期存放時(shí)容易分解成二磷酸腺苷(ADP)和一磷酸腺苷(AMP)，這兩種物質(zhì)不具有毒副作用，體內(nèi)與ATP存在相互轉(zhuǎn)化關(guān)系。但是，藥品注冊(cè)管理辦法規(guī)定有關(guān)物質(zhì)作為藥品質(zhì)量控制的指標(biāo)，必須規(guī)定限度。中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)和部頒生化藥品標(biāo)準(zhǔn)對(duì)ATP原料和制劑有關(guān)物質(zhì)未作要求，僅要求原料含量分別為大于95%和85%。曾依法測(cè)定了多個(gè)廠(chǎng)家上市的ATP水針制劑，有關(guān)物質(zhì)均在10%左右。ATP氯化鈉注射液采用精制高純度原料，含量高，制劑有關(guān)物質(zhì)低，確保了臨床應(yīng)用的有效性。

文中建立的質(zhì)量控制方法，能控制ATP氯化鈉注射液的質(zhì)量。按照2010年版《中國(guó)藥典(二部)》附錄ⅠB注射劑項(xiàng)下有關(guān)要求，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)還增加鑒別、細(xì)菌內(nèi)毒素和氯化鈉含量測(cè)定等項(xiàng)目，以確保藥品的安全有效。特殊安全性試驗(yàn)表明，ATP氯化鈉注射液對(duì)受試豚鼠無(wú)致敏作用，對(duì)家兔紅細(xì)胞無(wú)明顯體外溶血和凝集作用，對(duì)家兔耳緣靜脈亦無(wú)明顯刺激性，符合臨床安全性方面的要求。由此可見(jiàn)，ATP氯化鈉注射液安全、有效、質(zhì)量可控。

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[3]王 凱，汪素文.臨床肝病治療學(xué)[M].濟(jì)南:山東大學(xué)出版社，2002:80－90.

[4]劉小清.三磷酸腺苷二鈉氯化鈉注射液及其制備方法.中國(guó)，03142254.3[P].2004 － 03 － 31.

[5]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(二部)[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:28－29.