乙肝病毒X基因可調(diào)控表達(dá)細(xì)胞模型的構(gòu)建

白荷露 劉蕊 朱乃碩

我國是乙肝高發(fā)區(qū)，乙型肝炎表面抗原（HBsAg）攜帶率為7.18％，慢性乙型肝炎病毒感染者約9 300萬例［1］，每年由于HBV引起的肝硬化和肝癌造成263000人死亡［2］。HBV感染與原發(fā)性肝癌之間存在著密切關(guān)系，但由于缺乏有效的體外病毒感染和復(fù)制模型系統(tǒng)，乙肝及相關(guān)的原發(fā)性肝癌的基礎(chǔ)研究和臨床研究進(jìn)展緩慢［3，4］。目前常用的HBV細(xì)胞模型HepG2.2.15細(xì)胞系，由于其HBV DNA已穩(wěn)定地整合入肝細(xì)胞的基因組并持續(xù)表達(dá)，這種靜態(tài)結(jié)果無法反映病毒的天然感染過程，在表達(dá)量和表達(dá)時(shí)間上不可調(diào)控，使得基因功能的研究產(chǎn)生了很大的局限。建立適合的HBV感染模型對(duì)于探索其感染機(jī)制，尋找有效的防治方法及開展抗HBV藥物的篩選都具有重要的意義［5-7］。因此，我們選用受四環(huán)素調(diào)控的Tet-On慢病毒系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)乙肝病毒X基因（以下簡(jiǎn)稱HBx基因）的可調(diào)控表達(dá)［8］，并通過施與誘導(dǎo)劑的時(shí)間依賴性進(jìn)行精確轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而模擬HBV天然感染狀態(tài)以準(zhǔn)確獲得靶基因的功能分析。

1 材料與方法

1.1 材料

HBx基因來源于質(zhì)粒H85-T，該質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，含有C基因型，adr亞型的HBV病毒1.2倍基因組序列。菌株E.coli DH5α購自百泰克，人肝癌細(xì)胞株HepG2購自ATCC細(xì)胞庫。四環(huán)素誘導(dǎo)型慢病毒表達(dá)系統(tǒng)（Lentil-XTMTet-On Advanced Inducible Expression System，包括調(diào)控質(zhì)粒pLVXTet-On-Advanced和表達(dá)質(zhì)粒pLVX-Tight-Puro），病毒滴度測(cè)定試劑盒（Lentil-XTMp24 Rapid Titer Kit）購自Clontech公司。PrimerStar高保真聚合酶，EcoR I、Not I限制性內(nèi)切酶，T4連接酶，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司。Taq DNA聚合酶和dNTPs購自申能博彩公司。質(zhì)粒抽提試劑盒，膠回收試劑盒，PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自Axygen公司。強(qiáng)力霉素，嘌呤霉素，Polybrene購自Sigma公司，G418購自Gibco公司。鼠抗HBxAg單抗購自Abcam公司，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG多抗、FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG多抗、鼠抗GAPDH單克隆抗體購自上?？党缮锕?。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，測(cè)序由上海博尚生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴(kuò)增HBx基因片段 HBx基因序列共465bp。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的含有C基因型，adr亞型的HBV1.2倍基因組序列的H85-T質(zhì)粒，設(shè)計(jì)X基因引物，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。乙肝病毒X基因擴(kuò)增引物選用Not I和EcoR I酶切位點(diǎn)，引物序列為XF：5'-ATTTGCGGCCGCATGGCTGCTAGGGTGT3'，XR：5'-CCGGAATTCTTAGGCAGAGGTGAAAAAGTTG-3'。

應(yīng)用PrimerStar高保真聚合酶擴(kuò)增HBx基因，PCR 反應(yīng)條件為 ：98℃ 3min；98℃ 30s，57℃ 40s，72℃ 40s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。采用切膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增條帶。

1.2.2 HBx基因慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建 將HBx基因擴(kuò)增回收產(chǎn)物和pLVX-Tight-Puro載體分別用限制性內(nèi)切酶Not I和EcoR I雙酶切后純化回收，T4連接酶連接過夜，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)，氨芐青霉素篩選培養(yǎng)，挑取陽性克隆擴(kuò)增后提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR，雙酶切和DNA測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.3 慢病毒的制備和滴度測(cè)定 在100mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中接種4×106-5×106HEK293T細(xì)胞，培養(yǎng)過夜使細(xì)胞密度達(dá)到80％左右，將3μg構(gòu)建的表達(dá)載體質(zhì)粒與15μL的慢病毒包裝質(zhì)?；旌衔锘旌虾?，應(yīng)用試劑盒中的磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染到HEK 293T包裝細(xì)胞系中，8h后更換新鮮培養(yǎng)基，48h后收集培養(yǎng)上清，獲得包裝好的病毒顆粒，離心后分裝凍存。

采用病毒滴度測(cè)定試劑盒測(cè)定病毒P24含量（P24為HIV核心蛋白，其氨基酸序列高度保守，常用于病毒檢測(cè)），計(jì)算病毒的滴度。將收集的病毒上清液稀釋100倍后，與梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品一起加入包被有P24捕獲抗體的96微孔板中，依次加入生物素標(biāo)記的P24抗體，HRP標(biāo)記的鏈霉親和素，最終加入顯色液顯色。測(cè)定450nm吸光值（Spectrum M5微孔板檢測(cè)系統(tǒng)，Molecular Device公司），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算P24的量（單位為pg/mL），計(jì)算病毒的滴度。換算公式為1ng≈1.25×107LPs（LP表示病毒顆粒數(shù)量）。

1.2.4 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HBx基因的HepG2細(xì)胞系的構(gòu)建和鑒定 將HepG2細(xì)胞以2×105的密度接種于6孔板中，含有四環(huán)素調(diào)控元件rt-TA的病毒感染細(xì)胞，1200 g離心90min可提高感染效率。感染8h后換液用G418（600μg/mL）篩選，7-8d篩選穩(wěn)定后擴(kuò)大培養(yǎng)，再用含有HBx基因的病毒感染，8h后換液用Puromycin（0.5μg/mL）篩選，3-4d篩選穩(wěn)定后擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定細(xì)胞株HepG2-HBx（reg）。

提取HepG2-HBx（reg）細(xì)胞基因組DNA，以根據(jù)載體序列設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，四環(huán)素調(diào)控元件rt-TA序列驗(yàn)證引物：upper 5'-ACAAGGAAACTCGCTCAAA-3'，down 5'-GGCATAGAATCGGTGGTAG-3'。乙肝病毒X基因重組慢病毒質(zhì)粒的序列驗(yàn)證引物：upper 5'-TAGTGAACCGTCAGATCG-3'，down 5'-CAGACTGCCTTGGGAAAA-3'。反應(yīng)條件：94℃ 3min ；94℃ 30s，57℃ 40s，72℃ 40s，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。1％瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.5 反向PCR鑒定HBx基因及調(diào)控基因的整合 我們選用EcoR I酶對(duì)細(xì)胞基因組進(jìn)行酶解，pLVX-Tight-Puro-HBx和pLVX-Tet-On-Advanced質(zhì)粒均含有EcoR I的酶切位點(diǎn)，分別在靠近慢病毒質(zhì)粒的5' LTR區(qū)和靠近EcoR I區(qū)分別設(shè)計(jì)兩對(duì)上下游引物。pLVX-Tight-Puro-HBx第一對(duì)引物：pEH125：5'-TGTACTAGGAGGCTGTAGG-3'；pEH119：5'-GATCTTTGTACTAGGAGGCT-3'。pLVX-Tet-On-Advanced第一對(duì)引物：ToE112：5'-ATGCCCTTGACGACTTTG-3'；ToE41：5'-ACAGCTAAAGTGCGAAAG-3'。pLVX-Tight-Puro-HBx和pLVX-Tet-On-Advanced第二對(duì) 引 物 ：pEH232：5'-TTGTCTTCTTTGGGAGTG-3'；pEH287：5'-TCTGCTAATCAGGGAAGTA-3'。

選用EcoR I酶對(duì)細(xì)胞基因組總DNA充分酶解，50μL酶切體系中含有1μg基因組和5 U限制性內(nèi)切酶，37℃酶切5h。酶切片段純化后，溶于30μL 無菌水中。將 30μL 溶解產(chǎn)品于 400μL 自連接體系中16℃連接過夜。連接產(chǎn)品經(jīng)純化后溶于30μL無菌水中。半巢式PCR一擴(kuò)的PCR引物分別為pEH125/pEH119，ToE112/ToE41，PCR二擴(kuò)的引物為pEH232/pEH287。PCR反應(yīng)條件為：94℃ 5min ；94℃ 30s，57℃ 40s，72℃ 60s，35 個(gè)循環(huán) ；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收后連接到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選重組質(zhì)粒后測(cè)序克隆片段。

1.2.6 HBx基因可誘導(dǎo)表達(dá)的鑒定 將篩選穩(wěn)定的HepG2-HBx（reg）細(xì)胞均分為兩份，一份加Dox（1.0mg/mL）誘導(dǎo)培養(yǎng)，一份不加Dox（0mg/mL）培養(yǎng)，48h后收集細(xì)胞。

1.2.6.1 RT-PCR鑒定RNA的表達(dá) 提取細(xì)胞總RNA，DNase I處理后，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以HBx基因的特異性引物進(jìn)行PCR鑒定，引物為最初基因擴(kuò)增的引物，程序同DNA鑒定。β-actin內(nèi)參引物序列：F1379：5'-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3'；R1663：5'-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3'。

1.2.6.2 Western blot鑒定HBx蛋白的表達(dá) 利用RIPA蛋白抽提液提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白，經(jīng)過SDSPAGE電泳后，恒流300mA 1h電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，轉(zhuǎn)膜封閉后，依次加入鼠抗HBxAg單抗，HRP標(biāo)記抗IgG多抗孵育，NBT/BCIP 底物顯色，觀察蛋白的表達(dá)情況。

1.2.7 細(xì)胞免疫熒光試驗(yàn) 將篩選穩(wěn)定的HepG2-HBx（reg）細(xì)胞以105接種于12孔板，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。細(xì)胞分為4組，每組3個(gè)重復(fù)孔，分組情況如下：

自發(fā)熒光對(duì)照組：不加一抗和二抗（都用含1％BSA的PBS代替）；空白對(duì)照組：不加一抗（用含1％ BSA的PBS代替），直接加二抗；未誘導(dǎo)試驗(yàn)組：未加Dox（0mg/mL），加一抗，加二抗；誘導(dǎo)試驗(yàn)組：加Dox（1.0mg/mL），加一抗，加二抗。

待細(xì)胞已基本鋪滿蓋玻片時(shí)，用不完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12h后進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光試驗(yàn)，以排除小牛血清中蛋白對(duì)試驗(yàn)的影響。

將細(xì)胞用預(yù)冷的丙酮室溫固定于細(xì)胞板中，封閉2h后，在細(xì)胞孔內(nèi)滴入鼠抗HBxAg單抗，4℃濕盒內(nèi)孵育過夜，隨后加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG多抗室溫孵育30min，洗凈后于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光情況。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增HBx基因片段

HBx基因大小為465bp，PCR擴(kuò)增HBx基因產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后結(jié)果（圖1）顯示，其基因片段大小與預(yù)期的相符，表明已成功獲取HBx基因片段。

圖1 PCR擴(kuò)增X基因片段

重組質(zhì)粒pLVX-Tight-Puro-HBx經(jīng)PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，擴(kuò)增的條帶大小相符；經(jīng)限制性內(nèi)切酶Not I和EcoR I雙酶切驗(yàn)證，酶切條帶與目的基因大小相符（圖 2）。

圖2 pLVX-X基因重組質(zhì)粒PCR及酶切

2.2 慢病毒的制備和滴度測(cè)定

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48h收集上清獲得重組病毒顆粒，經(jīng)病毒滴度試劑盒檢測(cè)，包裝出的病毒滴度約在108LPs/mL左右。

2.3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系HepG2-HBx（reg）的構(gòu)建與鑒定

含有四環(huán)素調(diào)控元件rt-TA和HBx基因的重組病毒顆粒先后感染細(xì)胞，分別用600μg/mL濃度的G418和1.0μg/mL濃度的Puromycin篩選細(xì)胞，獲得穩(wěn)定細(xì)胞株HepG2-HBx（reg）。PCR擴(kuò)增鑒定結(jié)果如圖3所示，證明了HepG2-HBx（reg）細(xì)胞中同時(shí)含有四環(huán)素調(diào)控元件和乙肝病毒X基因。

圖3 HepG2-HBx（reg）細(xì)胞PCR鑒定

2.4 反向PCR鑒定HBx基因的整合

應(yīng)用反向PCR對(duì)于慢病毒載體介導(dǎo)基因的整合進(jìn)行了驗(yàn)證，二輪PCR鑒定結(jié)果如圖4及圖5所示。對(duì)上述挑取的克隆進(jìn)行測(cè)序分析，通過對(duì)插入位點(diǎn)旁側(cè)序列的比對(duì)分析，其序列確是人類基因組中序列，分布于不同染色體中。pLVX-Tight-Puro-HBx反向轉(zhuǎn)化子共挑取10個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫比對(duì)，發(fā)現(xiàn)了7個(gè)插入位點(diǎn)（表1）；pLVX-Tet-On-Advanced反向轉(zhuǎn)化子共挑取8個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)了4個(gè)插入位點(diǎn)（表2）。證明慢病毒感染HepG2細(xì)胞后目的基因的確整合于細(xì)胞基因組中。

2.5 HepG2-HBx（reg）細(xì)胞中X基因可誘導(dǎo)表達(dá)的鑒定

RT-PCR結(jié)果（圖4）顯示，加入Dox誘導(dǎo)的細(xì)胞中檢測(cè)到X基因的RNA表達(dá)，而沒有加入Dox（0mg/mL）的細(xì)胞中則檢測(cè)不到X基因的RNA表達(dá)。Western blot試驗(yàn)結(jié)果顯示同上，加入Dox（1.0mg/mL）誘導(dǎo)的細(xì)胞中檢測(cè)到X基因的蛋白表達(dá)，而未加入Dox的細(xì)胞中則檢測(cè)不到X基因的蛋白表達(dá)（圖5），HBV X蛋白大小約為17kD，內(nèi)參β-actin蛋白檢測(cè)條帶大小約為42kD，試驗(yàn)結(jié)果與理論值基本相符，說明可誘導(dǎo)表達(dá)細(xì)胞試驗(yàn)?zāi)Ｐ蜆?gòu)建成功。

表1 pLVX-Tight-Puro-HBx反向轉(zhuǎn)化子整合位點(diǎn)旁側(cè)序列分析

表2 pLVX-Tet-On-Advanced反向轉(zhuǎn)化子整合位點(diǎn)旁側(cè)序列分析

圖4 HepG2-HBx（reg）細(xì)胞RT-PCR誘導(dǎo)表達(dá)驗(yàn)證

2.6 HepG2-HBx（reg）細(xì)胞免疫熒光試驗(yàn)

在放大400倍（目鏡10×物鏡40）的熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果（圖6）顯示，

圖5 HepG2-HBx（reg）細(xì)胞Western blot誘導(dǎo)表達(dá)驗(yàn)證

3 討論

針對(duì)病毒性肝炎的研究，抗病毒藥物的開發(fā)和評(píng)價(jià)中的重要環(huán)節(jié)之一就是建立一種方便有效，且與人類天然感染近似的試驗(yàn)?zāi)Ｐ汀ｋS著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，有關(guān)HBV的細(xì)胞和動(dòng)物模型相繼建立?，F(xiàn)有HBV體外感染的細(xì)胞模型主要包括人原代肝細(xì)胞（primaryhumanhepatocytes，PHH）、HepRG細(xì)胞和HepG2.2.15細(xì)胞等［9-11］，但其均有各自的缺陷。PHH細(xì)胞的分離和體外培養(yǎng)較困難；HepRG細(xì)胞培養(yǎng)需DMSO化學(xué)誘導(dǎo)，可能對(duì)HBV感染和表達(dá)過程有所影響［11，12］；HepG2.2.15細(xì)胞是目前應(yīng)用較為廣泛的細(xì)胞模型，但由于其HBV DNA已穩(wěn)定地整合入肝細(xì)胞的基因組，無法模擬HBV天然的感染過程［6］。目前，在實(shí)驗(yàn)室中構(gòu)建的多數(shù)HBx研究模型，是在外源強(qiáng)啟動(dòng)子（如CMV啟動(dòng)子）控制下穩(wěn)定的表達(dá)，以非整合病毒來源的載體為工具研究其在誘發(fā)肝炎和肝癌形成中的作用，而這并不理想［13］。

慢病毒具有可以有效地整合入宿主細(xì)胞并穩(wěn)加入Dox（1.0mg/mL）誘導(dǎo)的細(xì)胞于熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，而沒有加入Dox（0mg/mL）的細(xì)胞中則沒有觀測(cè)到綠色熒光。再次證明可誘導(dǎo)表達(dá)細(xì)胞試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臉?gòu)建成功。

圖6 HepG2-HBx（reg）細(xì)胞免疫熒光試驗(yàn)

上述多種試驗(yàn)方法的結(jié)果說明了HBx基因在細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了蛋白表達(dá)的可調(diào)控性，將為開展乙肝病毒持續(xù)感染和致病的研究，以及抗HBV藥物的篩選提供較為理想的試驗(yàn)?zāi)Ｐ?。定表達(dá)外源基因的優(yōu)勢(shì)，并不易誘發(fā)免疫反應(yīng)，適用于體內(nèi)基因治療，是一種較為理想的基因轉(zhuǎn)移載體［14］。本試驗(yàn)利用已廣泛運(yùn)用的Tet-On調(diào)控系統(tǒng)，應(yīng)用慢病毒感染的途徑成功構(gòu)建了乙肝病毒X基因的可調(diào)控表達(dá)細(xì)胞模型，應(yīng)用多種方法鑒定了HBx基因的誘導(dǎo)表達(dá)，實(shí)現(xiàn)蛋白表達(dá)的可調(diào)控性。

實(shí)驗(yàn)室同時(shí)構(gòu)建了HBV其他基因的可調(diào)控細(xì)胞模型，擬在細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上，通過人為控制蛋白的表達(dá)來觀察HBV蛋白表達(dá)前后細(xì)胞內(nèi)的整體變化趨勢(shì)，更全面系統(tǒng)地研究HBV對(duì)宿主的影響。隨后，我們擬通過芯片和蛋白質(zhì)組學(xué)等方法分析這些病毒組分感染宿主的過程中對(duì)宿主的MicroRNA及蛋白質(zhì)組的影響，特別是一些機(jī)體免疫和腫瘤發(fā)生相關(guān)分子的變化，進(jìn)一步對(duì)其在宿主內(nèi)改變表觀遺傳修飾及形成免疫耐受的作用機(jī)理進(jìn)行深入研究。

4 結(jié)論

本研究應(yīng)用四環(huán)素Tet-On調(diào)控系統(tǒng)構(gòu)建了乙肝病毒X基因的誘導(dǎo)表達(dá)載體，經(jīng)HEK 293T細(xì)胞包裝獲得含有調(diào)控元件rt-TA和HBx基因的病毒顆粒，P24法測(cè)定滴度達(dá)到108LPs/mL。將兩種病毒先后感染HepG2細(xì)胞系，經(jīng)G418和Puromycin抗生素篩選獲得整合有HBx基因的穩(wěn)定細(xì)胞株HepG2-HBx（reg），并應(yīng)用RT-PCR和Western blot等方法驗(yàn)證了HBx基因的可誘導(dǎo)表達(dá)。該細(xì)胞模型的成功構(gòu)建為研究HBx基因在對(duì)宿主感染致病和免疫耐受中的作用提供了一種較理想的試驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

致謝：本實(shí)驗(yàn)室博士研究生湯必奎和碩士研究生孫勇曾對(duì)本課題的研究和部分試驗(yàn)內(nèi)容給予幫助，在此由衷的表示感謝。

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