糖尿病腎病大鼠蛋白尿和腎組織WT 1表達的相關性研究

張 堃 池艷春 郭 靜

哈爾濱醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院腎內科，黑龍江哈爾濱 150001

蛋白尿是糖尿病腎病（DN）主要臨床表現(xiàn)，也是引起腎臟損傷的獨立危險因素，因此積極探討蛋白尿的發(fā)生機制以及病理改變，對于臨床DN的防治具有重大而深遠的意義。近年來，足細胞的相關蛋白分子成為研究蛋白尿的發(fā)生、發(fā)展的熱點，而WT1也成為影響足細胞功能的重要因子，對其研究發(fā)現(xiàn)可作為判定糖尿病腎病的早期指標。

1 材料與方法

1.1 實驗模型的制備

雄性 Wistar大鼠 56只，體重 200～300 g，適應性飼養(yǎng)1周后，隨機將其分為兩組，對照組（6只）和模型組（50只）。除對照組，其余所有大鼠均行戊巴比妥鈉腹腔麻醉（30 mg/kg）后行右腎切除術，2周后給予腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ，溶于0.1 mol/L枸椽酸緩沖液中，pH=4.5，65 mg/kg）；對照組僅注射相同數(shù)量的枸椽酸緩沖液。48 h后從尾靜脈采血用微量血糖儀測定血糖，試紙法測定尿糖。連續(xù)3d空腹血糖≥16.7mmol/L，尿糖強陽性視為糖尿病大鼠模型成功。4周后，測定24 h尿蛋白量﹥30 mg為DN成模標準，未成功者剔除。 分別于 STZ 注射成模后第 1、2、4、8、12 周處死各模型組大鼠6只，各時間點大鼠處死前代謝籠內收集24 h尿液，-20℃保存待測；處死大鼠后用生理鹽水灌冼，取左腎留取腎皮質，一部分用于病理切片觀察和免疫組化檢查；另一部分用于Western blot檢測。對照組大鼠于第1、2、4、8、12周收集代謝籠24 h尿液測定蛋白量，12周時處死留取腎皮質分別做上述檢測。

表1 對照組與各模型組大鼠24 h尿蛋白定量的比較（mg，±s）

表1 對照組與各模型組大鼠24 h尿蛋白定量的比較（mg，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05

對照組模型組66 7.82±2.09 39.63±13.01*7.59±2.44 60.51±7.37*7.92±2.89 75.96±18.28*8.53±2.47 90.97±14.19*9.15±2.26 114.74±12.91*組別 只數(shù) 1周 2周 4周 8周 12周

1.2 儀器與試劑

STZ（美國 Sigma 公司），苯甲基磺酰氟（PMSF，美國Sigma公司），醋酸纖維膜（美國Pall公司），單克隆鼠抗WT1抗體（美國Santa公司），兔抗鼠IgG（美國Santa公司），血糖儀和試紙（美國強生公司），二辛可寧酸（BCA）蛋白檢測試劑盒（美國Pierce公司），光學顯微鏡（日本Olympus公司），組織勻漿機（德國Heidolph公司），Singmal-15K型低溫高速離心機 （德國EPPENDORF公司），紫外-可見分光光度計（日本島津公司），BIORAD GS-800圖像分析系統(tǒng) （美國Bio-Rad公司），X-光膠片（美國柯達）。

1.3 檢測項目

1.3.1 24 h尿蛋白定量 各組大鼠在處死前收集代謝籠內24 h尿液測定尿蛋白量，取4 mL尿液，2000 r/min離心10 min，去除沉渣并于-20℃保存，采用BCA法檢測24 h尿蛋白量。

1.3.2 腎臟組織學檢查 ①組織學采用光學顯微鏡觀察：脫蠟和水化、蘇木素染色、伊紅染色、復染、常規(guī)脫水、封片、鏡檢。②新鮮組織經(jīng)固定，脫水，石蠟包埋進行免疫組化檢查，WT1定位。

1.3.3 Western blot 將大鼠的腎臟組織剪碎，冰上稱取大鼠腎皮質 100 mg，加入 400 μL（含 PMSF）裂解液于勻漿器中進行勻漿，然后置于冰上經(jīng)勻漿器和裂解儀和勻組織，提取蛋白，Braford法測定蛋白濃度。將組織液與緩沖液一起加熱、上樣，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳后轉膜、抗體雜交、顯影、洗膜、孵育、曝光、定影后得到蛋白印跡，并用考馬斯亮藍法測定吸光光度值，內參為β-actin，從而確定WT1的含量。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 15.0對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠的一般狀態(tài)

實驗過程中，對照組大鼠精神狀態(tài)較好，無多食、多尿、多飲，均成活無死亡。造模成功后，模型組大鼠精神狀態(tài)較萎靡，毛色晦暗無光澤，活動少反應較差，多食、多尿、多飲、消瘦等；模型組大鼠在4周時死亡1只，8周時死亡2只，12周時死亡3只。

2.2 24 h尿蛋白定量

對照組大鼠24 h尿蛋白量低于模型組（P＜0.05）；在第4周時，模型組大鼠的尿蛋白量開始明顯增多，在第12周時達到最大量。結果見表1。

2.3 光鏡觀察

對照組大鼠腎小球、腎小管、腎間質無病理性改變，結果見圖1。在模型組大鼠中，從第4周開始就可以發(fā)現(xiàn)足突變形，結果見圖2；在第8周時可見足突融合，結果見圖3；在第12周時可見部分腎小球體積增大，并伴有系膜細胞、基質增生，足細胞足突融合略有加重，部分上皮細胞空泡變性，腎小管擴張，間質區(qū)可見淋巴細胞等，結果見圖4。

2.4 免疫組化結果

在腎小管、腎間質中幾乎無WT1的表達，WT1表達在腎小球中且位于足細胞的細胞核內，染色呈灰棕色；其染色程度隨著尿蛋白量的增多逐漸深染；在第12周時，足細胞的細胞核被染成咖啡色。結果見圖 5、6。

2.5 Western blot結果

模型組的WT1表達量從第1周開始逐漸增加，但第1、2周模型組與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），從第4周開始，各模型組大鼠WT1表達量與對照組相比均增多，且差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05）。 見圖7和表2。

2.6 24 h尿蛋白量與WT1的相關性結果

各模型組大鼠不同時間點的WT1表達量與24 h尿蛋白量之間存在著顯著的正相關關系（r=0.723 52，P ＜ 0.01）。

3 討論

圖1 對照組（HE染色，400×）

圖2 模型4周組（HE染色，400×）

圖3 模型8周組（HE染色，400×）

圖4 模型12周組（HE染色，400×）

圖5 對照組（12周，400×，免疫組化）

圖6 模型組（12周，400×，免疫組化）

表2 對照組與各模型組大鼠WT1蛋白表達水平比較（±s）

表2 對照組與各模型組大鼠WT1蛋白表達水平比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05

對照組模型1周組模型2周組模型4周組模型8周組模型12周組666666 0.19±0.12 0.43±0.41*0.56±0.36*1.04±0.45*1.51±0.79*2.02±1.06*組別 只數(shù) WT1吸光度/β-actin吸光度

糖尿病是一種內分泌代謝性疾病，它較少直接導致死亡，其真正致死、致殘的原因是其嚴重的并發(fā)癥，DN即屬于糖尿病三大并發(fā)癥之一，是糖尿病全身性微血管病變之一[1]。DN患者的微血管發(fā)生病變，出現(xiàn)糖尿病性腎小球硬化癥。DN早期腎體積增大，腎小球濾過率增加，呈高濾過狀態(tài)，以后逐漸出現(xiàn)間隙蛋白尿或微量白蛋白尿，隨著病程的延長，出現(xiàn)持續(xù)蛋白尿、水腫、高血壓、腎小球濾過率降低，進而出現(xiàn)腎功能不全、尿毒癥[2]。因此，若能早期診斷DN，并采取有效的預防性治療，對阻止糖尿病腎病的發(fā)展有重要意義[3]。對已有明顯腎病的患者應盡可能減慢腎小球濾過率的下降和SCr上升的速度，以減慢腎臟損害的速度[4]。

蛋白尿不僅是DN早期的主要臨床表現(xiàn)，而且是促進DN進展的重要獨立危險因素，在蛋白尿的發(fā)生中腎小球臟層上皮細胞即足細胞的改變起重要作用。足細胞分子和電荷屏障損傷在DN起始和蛋白尿、腎小球硬化發(fā)生發(fā)展中起重要作用[5]。近年發(fā)現(xiàn)，足細胞上的蛋白對于維持足細胞正常結構和腎小球濾過屏障的功能起著重要作用[6]。WT1是一個腫瘤抑制基因，對泌尿生殖系統(tǒng)的發(fā)育有重要的意義[7]。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)WT1與許多腎小球疾病的發(fā)生有密切關聯(lián)。腎臟形成后，其表達僅限于足細胞中，對維持正常的足細胞功能起著非常重要的作用[8]。Denys-Drash綜合征（以腎小球迅速發(fā)展為終末期腎病、男性假兩性畸形、Wilms′腫瘤三聯(lián)征為特征）是由WT1突變引起的疾病，其腎臟功能損害程度與廣泛的腎小球硬化和嚴重的足突細胞變異有關[9]。Guo等[10]證明，WT1表達水平的減少，將導致腎小球腎炎，其嚴重性依賴基因量的多少。也有報道稱[11]，足細胞內WT1表達的減少或缺失與突變蛋白的結合能力下降程度相符。

本實驗觀察了WT1蛋白在DN大鼠模型中的表達，驗證了WT1蛋白存在于細胞核中，與文獻提到的相符。 在模型組的第 1、2、4、8、12 周，隨著 DN 大鼠尿蛋白量的不斷增多，腎小球系膜硬化逐步加重，足突部分融合，WT1蛋白表達水平呈現(xiàn)進行性上升的趨勢。這一現(xiàn)象與Guo等[10]證明，WT1蛋白表達水平的減少，將導致腎小球腎炎，其嚴重性依賴基因量的多少的現(xiàn)象似乎是不一致的。本實驗中，模型組大鼠WT1蛋白的表達量從第1周開始增加至第12周，從而可以推斷足細胞的變異性改變激發(fā)WT1蛋白代償性的增加，隨尿蛋白量的增加WT1蛋白的表達呈現(xiàn)出增多的趨勢，但是這種趨勢可能是破壞了WT1蛋白原有的增殖體系，破壞了其他維系足細胞分子平衡的機制，因而導致足突的病理改變加重，其功能也隨之降低，導致尿蛋白量也隨之增多。但在本實驗中，模型組大鼠的初、末時間觀察點分別在第1周及第12周末，而在此兩個觀察點前后的時間段，WTI蛋白的變化并沒有用實驗進一步去探究，所以其變化仍不明確；雖然WT1蛋白的表達量與24 h尿蛋白量之間存在著顯著的正相關關系，但是，其相關性僅為72.352%，所以以WT1蛋白來評估早期足細胞損害的程度還有欠缺之處，仍然需要探究證實。

DN治療的關鍵在于早期診斷及治療，DN的早期表現(xiàn)主要是尿微量白蛋白（U-mAlb）的升高，對早期DN U-mAlb的治療可明顯延緩DN進入終末期腎病的時間，DN一旦進展成臨床蛋白尿期，腎損害是難以可逆的，有效控制早期DN的進展是目前DM臨床的重要課題[12]，所以WT1蛋白在提示足細胞早期損傷方面有著重要意義，但其與足細胞損害程度導致蛋白尿產(chǎn)生的相關性還有局限，需待進一步去探索證實。

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