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    熒光定量PCR法檢測線粒體基因A1555G與C1494T突變

    2013-09-13 12:19:26林文津郭舜民徐榕青肖志勇張亞敏
    中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào) 2013年28期
    關(guān)鍵詞:藥源性糖苷耳聾

    林文津 郭舜民 徐榕青 肖志勇 張亞敏

    1.福建省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院 福建省醫(yī)學(xué)測試重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建福州 350001;2.福建省福州市第二醫(yī)院,福建福州 350007

    線粒體12SrRNA基因是氨基糖苷類抗生素導(dǎo)致的非綜合征型聽力損失的一個突變熱點(diǎn)區(qū)域。由于A1555G和C1494T突變在12SrRNA基因形成G-C和U-A配對使得與氨基糖苷類抗生素的結(jié)合更加容易,這就是為何攜帶這些突變的人在接觸了氨基糖苷類抗生素時會出現(xiàn)或加重耳聾的原因[1]。因此,對這兩個點(diǎn)突變的檢測,對于預(yù)防氨基糖苷類抗生素中毒性耳聾有著重要的臨床意義。目前關(guān)于線粒體耳聾基因的檢測方法有多種,文獻(xiàn)已報(bào)道的方法有酶切法[2-3]、直接測序法[2-6]、基因芯片法[7-10]、實(shí)時熒光定量Taqman探針法[11]等。檢測的突變熱點(diǎn)主要是1555、1494、961等[12-13]。本次試驗(yàn)采用熒光定量PCR法檢測95例非綜合征藥源性耳聾患者及其家屬線粒體基因A1555G、C1494T突變,并采用傳統(tǒng)的毛細(xì)管電泳測序法進(jìn)行確證,現(xiàn)將檢測結(jié)果報(bào)道如下:

    1 資料與方法

    1.1 一般資料

    95例非綜合征型耳聾患者及其家屬均為漢族,其中,男44例 女51例,聾病先證者54例(男39例,女15例)。經(jīng)知情同意后,首先對先證者及其家屬進(jìn)行病史調(diào)查,包括家族史、耳聾史及耳毒性藥物的使用情況等,同時進(jìn)行純音聽域測試,明確先證者均為非綜合征型耳聾。

    1.2 儀器與試劑

    PCR擴(kuò)增儀(Bio-Rad公司);ABI 3130測序儀、ABI 7500熒光定量 PCR 儀(Applied Biosystems)。Taq酶、dNTP(北京百泰克生物技術(shù)有限公司);測序引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司);藥物性耳聾基因突變檢測試劑盒及陽性對照試劑(智海生物工程北京有限公司)。

    1.3 全血基因組DNA提取

    用枸櫞酸鈉抗凝的一次性采血管,取受檢者的外周靜脈血約2 mL,采用離心吸附柱法按照血液基因組DNA提取試劑盒的操作說明書操作,提取受檢者全血基因組DNA,用瓊脂糖凝膠(1%)電泳檢測。所提取的DNA條帶清晰,完整性好,紫外分光光度計(jì)檢測DNA 濃度約為 50 ng/μL。

    1.4 熒光定量PCR檢測

    取出試劑盒中擴(kuò)增反應(yīng)液,解凍后取18 μL,再加入2 μL提取得到的DNA或?qū)φ掌啡芤海靹?,然后上機(jī)進(jìn)行檢測。溫度循環(huán)程序分4個步驟:①37℃5 min,1 個循環(huán);②95℃ 15 min,1 個循環(huán);③95℃ 15 s,54℃ 20 s,72℃ 20 s,40 個循環(huán);④95℃ 15 s,60℃1 min,95℃ 15s,60℃ 15 s,1 個循環(huán),進(jìn)行熔解曲線分析。

    1.5 mtDNA測序

    1.5.1 PCR反應(yīng) PCR引物根據(jù)從 NCBI下載的人線粒體基因組序列,利用Gene Tools軟件自行設(shè)計(jì),所設(shè)計(jì)引物的PCR產(chǎn)物為線粒體1262~1772位點(diǎn),共計(jì)511 bp,能同時檢測1494與1555位點(diǎn)的突變。PCR反應(yīng)體系見表1。PCR程序:①94℃ 5 min,1個循環(huán);②94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 1 min,32 個循環(huán);③72℃ 10 min,1 個循環(huán)。

    表1 PCR反應(yīng)體系

    1.5.2 測序 將PCR產(chǎn)物經(jīng)常規(guī)方法制備成測序模板后用傳統(tǒng)的雙脫氧鏈終止法在ABI 3130測序儀上測序分析。

    2 結(jié)果

    2.1 熒光定量PCR檢測結(jié)果

    除空白對照組外,各反應(yīng)管均出現(xiàn)特異性擴(kuò)增,各PCR產(chǎn)物的Tm值之間均能很好的進(jìn)行區(qū)分(大于2℃),1494T 標(biāo)準(zhǔn)對照管出現(xiàn) 78.2℃和 84.5℃的熔解峰,分別為1494T和質(zhì)控峰(圖1A);1555G標(biāo)準(zhǔn)對照管主要出現(xiàn)74.9℃和84.1℃的熔解峰,分別為1555G和質(zhì)控峰(圖 1B);1555G陽性患者出現(xiàn) 75.7℃和84.8℃的熔解峰,分別為 1555G 和質(zhì)控峰(圖 1C);正常人僅出現(xiàn)1個84.2℃的熔解峰,為質(zhì)控峰(圖1D);以無菌雙蒸水為模板的空白對照為一直線,未見熔解峰(圖1E)。綜合上述檢測結(jié)果,可以判定在75℃附近出現(xiàn)熔解峰,說明有A1555G突變,在78℃出現(xiàn)熔解峰,說明有C1494T突變,正常人僅在84℃附近出現(xiàn)熔解峰。

    根據(jù)上述判定方法,本試驗(yàn)共發(fā)現(xiàn)4例A1555G突變患者,占先證者7.41%,占高危人群(先證者及其家屬)4.26%,未發(fā)現(xiàn)C1494T突變患者,見表2。采用PASWSTAT統(tǒng)計(jì)軟件,經(jīng)交叉表McNemar檢驗(yàn)分析,P=1.000,說明兩種方法檢測效果相同。

    圖1 熒光定量PCR法檢測的熔解曲線圖

    表2 熒光定量PCR法與測序法檢測結(jié)果比較(例)

    2.2 線粒體基因序列分析

    運(yùn)用GeneTools軟件將測序結(jié)果與NCBI網(wǎng)站上公布的人線粒體基因標(biāo)準(zhǔn)序列比對,結(jié)果顯示僅這4例陽性患者線粒體基因發(fā)生了線粒體基因 A1555G突變。所有檢測結(jié)果均與所測標(biāo)本的真實(shí)結(jié)果一致,從而驗(yàn)證了本方法是準(zhǔn)確有效的。結(jié)果提示,線粒體基因A1555G突變可能是這4例患者非綜合征耳聾遺傳易感性的分子基礎(chǔ)。查閱患者病例資料發(fā)現(xiàn),該4例A1555G陽性患者雙耳均出現(xiàn)了不同程度的聽力損傷,且均為女性,其中兩位為母女關(guān)系,這也從側(cè)面反映了藥源性耳聾這一線粒體病呈現(xiàn)出母系遺傳的特點(diǎn)。

    3 討論

    氨基糖苷類抗生素包括慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素、妥布霉素等,因其對革蘭陰性菌的感染特別有效,同時對于某些革蘭陽性菌也有協(xié)同抗菌作用,在臨床上仍在廣泛使用。此外,疫苗是另一個潛在的危險(xiǎn)因素,大多數(shù)人并不知道疫苗中含有氨基糖苷類抗生素,如國家計(jì)劃免疫的麻疹疫苗中含有新霉素,水痘疫苗中含有新霉素,甲流疫苗中含有硫酸慶大霉素。線粒體基因突變與藥源性耳聾的關(guān)系研究的比較清楚,突變攜帶者就是藥源性耳聾的敏感個體。藥源性耳聾尚無有效治療方法,唯一的辦法就是預(yù)防。通過基因檢測,發(fā)現(xiàn)基因突變的攜帶者,盡早干預(yù),可以預(yù)防藥源性耳聾的發(fā)生。

    本試驗(yàn)采用特異引物延伸技術(shù)結(jié)合實(shí)時熒光定量PCR技術(shù),通過PCR產(chǎn)物Tm值的差異來實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)突變的檢測,當(dāng)有突變型核酸存在的情況下,針對突變型設(shè)計(jì)的序列特異性引物得到延伸產(chǎn)生特定的PCR產(chǎn)物,同時在每個反應(yīng)體系中加入了熒光物質(zhì),擴(kuò)增完成后,熒光物質(zhì)結(jié)合到PCR產(chǎn)物中,在進(jìn)行熔解曲線分析后,不同的PCR產(chǎn)物將產(chǎn)生不同的熔解峰(即熔解峰所對應(yīng)的溫度值不同),從而達(dá)到一個反應(yīng)同時檢測兩個突變的結(jié)果。所購買的試劑盒中未提供陽性對照,由該公司另行提供。為方便判斷C1494T和A1555G突變的熔解峰峰位,本試驗(yàn)將2個陽性標(biāo)準(zhǔn)對照分別檢測,發(fā)現(xiàn)1555G突變?nèi)劢夥宄霈F(xiàn)在75℃,1494T突變?nèi)劢夥宄霈F(xiàn)在78℃;結(jié)果圖1B中1555G熔解曲線除了出現(xiàn)特異性產(chǎn)物熔解峰外還出現(xiàn)了較多的雜峰,可能與該公司提供的標(biāo)準(zhǔn)對照濃度太低有關(guān),但不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判定。

    對藥源性耳聾基因突變的檢測方法,除本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的方法外,還有直接測序法、實(shí)時熒光定量Taqman探針法、耳聾基因芯片法、酶切法等。直接測序法雖然是鑒定突變的金標(biāo)準(zhǔn),但操作繁瑣、需專門的培訓(xùn),結(jié)果判讀復(fù)雜。Taqman探針法與本方法比較,雖然用的均為熒光定量PCR儀,但本法能在一管中實(shí)現(xiàn)兩個位點(diǎn)的檢測,成本低廉、結(jié)果判讀容易。目前芯片方法需要1次同時檢測9個常見耳聾基因突變位點(diǎn),成本較高,不適合單獨(dú)針對藥源性耳聾患者的臨床篩查。酶切法雖然不需要用到熒光定量PCR儀,但操作較復(fù)雜,特異性差,需跑電泳(電泳膠需要額外配制,而且含致癌物質(zhì)),容易污染。本實(shí)驗(yàn)儀器要求簡單,費(fèi)用低,操作簡單,無需酶切或電泳,同時整個過程除加入模板外無需進(jìn)行開蓋操作,有效避免污染的產(chǎn)生,能夠簡單、快速、準(zhǔn)確的實(shí)現(xiàn)2個點(diǎn)突變的同時檢測或單獨(dú)檢測。

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