原發(fā)性肝癌組織及細(xì)胞系中DNMT mRNA表達(dá)的檢測(cè)及意義

高 波，李海平，余宗濤，呂 軍，張吉才

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 十堰 442000)

我們既往的研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肝癌組織中p16基因發(fā)生甲基化的頻率非常高，并且通過(guò)分組發(fā)現(xiàn)乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染相關(guān)肝癌的p16基因甲基化的頻率要高于非HBV相關(guān)肝癌，提示HBV的持續(xù)感染對(duì)p16基因的異常甲基化有一定作用，但其作用機(jī)制尚不明確[1-3]?；虻漠惓＜谆赡芘c多種因素有關(guān)，包括甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)水平、致癌物接觸、基因修復(fù)缺陷等，其中DNMT是調(diào)節(jié)甲基化的主要因素。為了解HBV感染與DNMT表達(dá)之間的關(guān)系，本研究采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)檢測(cè)44例原發(fā)性肝癌組織和HBV相關(guān)肝癌細(xì)胞系Hep3B、非HBV相關(guān)肝癌細(xì)胞系HepG2中4 種 DNMT mRNA(DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B)的表達(dá)情況，初步探討DNMT mRNA表達(dá)改變與HBV感染及肝癌等的關(guān)系。

材料和方法

一、臨床資料

收集太和醫(yī)院2010年12月1日至2012年2月1日的肝癌患者術(shù)后新鮮癌組織標(biāo)本44例，患者男35例，女9例。所有組織標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)確診，臨床資料完整。組織標(biāo)本收集后液氮中保存?zhèn)溆?。根?jù)患者血清中HBV標(biāo)志物的存在與否，將癌組織分為2組。HBV相關(guān)性肝癌組:共32例，患者血液標(biāo)本中至少檢測(cè)出一種HBV感染的標(biāo)志物，HBsAg、HBeAg、抗 HBe、抗 HBc 或 HBV DNA;非HBV相關(guān)性肝癌組:血液標(biāo)本中未檢測(cè)出任何一種HBV感染標(biāo)志物，共12例。

二、細(xì)胞及主要儀器試劑

肝癌細(xì)胞系Hep3B和HepG2購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，來(lái)自于美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心;細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM、小牛血清均購(gòu)于GIBCO公司;Trizol Reagent(Invitrogen公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promege公司);PCR試劑(上海生工公司);PCR儀PE7500(ABI公司);SYBR GreenⅠ染料(Gene公司);G-BOX紫外凝膠成像系統(tǒng)(Gene公司);ND-2000微量核酸定量?jī)x(美國(guó)NanoDrop公司);150 bp DNA mark(上海生工公司);DNA mark(北京天根公司);TG-16WS臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(日立公司)。

三、方法

1.PCR引物設(shè)計(jì)與合成 DNMT1:5'-CGACTACATCAAAGGCAGCAACCTG-3'，5'-TGGAGTGGACTTGTGGGTGTTCTC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物 166 bp;DNMT2:5'-AAGCTGTAAGCCAGCCCATATAC-3'，5'-TCAGCAGTGAACAGAACCTACATG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物148 bp;DNMT3A:5'-CGAGTCCAACCCTGTGATGATTG-3'，5'-GCTGGTCTTTGCCCTGCTTTATG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物221 bp;DNMT3B:5'-TTGGAATAGGGGACCTCGTGTG-3'，5'-AGAGACCTCGGAGAACTTGCCATC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物 152 bp;GAPDH:5'-GAAGGTGAAGTCGGAGTC-3'，5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物226 bp。所有引物合成由北京賽百盛公司完成。

2.細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株HepG2(HBsAg陰性)和Hep3B(HBV陽(yáng)性)待復(fù)蘇后培養(yǎng)于含100 mL/L小牛血清、100 kU/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的 DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)在6孔培養(yǎng)板中，置于5%CO2的37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱，每3～4天消化傳代1次。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，先把培養(yǎng)液抽干，加入3 mL 0.05%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化細(xì)胞，置于37℃ 2 min后收集細(xì)胞，再以磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞備用。

3.癌組織及細(xì)胞總RNA提取 參照Trizol說(shuō)明書提取細(xì)胞中總RNA。

4.逆轉(zhuǎn)錄 參照試劑盒說(shuō)明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

5.PCR擴(kuò)增 按試劑盒要求操作。反應(yīng)條件:95℃ 預(yù)變性3 min;95℃ 30 s，55℃ 1 min，72℃1 min，共40個(gè)循環(huán);最后一循環(huán)于72℃ 5 min。

6.結(jié)果判斷 基因相對(duì)定量方法:利用檢測(cè)得到的Ct值和計(jì)算得到的擴(kuò)增效率，以參比基因(GAPDH)為內(nèi)參，計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。R=Test mRNA/參比 mRNA=(1+E參比)Ct(參比)/(1+E)Ct(test)test

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行結(jié)果分析，計(jì)量資料經(jīng)檢驗(yàn)符合正態(tài)分布的，采用表示，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、DNMT mRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR的建立

2種肝癌細(xì)胞系重復(fù)5次培養(yǎng)，收集細(xì)胞后提取總RNA，待濃度和純度符合要求后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增，最后進(jìn)行各個(gè)基因表達(dá)檢測(cè)，基因表達(dá)的結(jié)果用表示。檢測(cè)4種DNMT mRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR均具有比較好的特異性，熔點(diǎn)曲線見(jiàn)圖1。

二、4種DNMT mRNA在肝癌細(xì)胞系Hep3B與HepG2中的表達(dá)

Hep3B細(xì)胞系中 DNMT1、DNMT3A、DNMT3B mRNA表達(dá)高于 HepG2細(xì)胞系(P＜0.01)。見(jiàn)表1。

三、原發(fā)性肝癌患者肝癌組織DNMT mRNA表達(dá)的分析

HBV感染相關(guān)癌組織中 DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA表達(dá)水平明顯高于非HBV感染相關(guān)癌組織(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

圖1 DNMT和GAPDH的熔點(diǎn)曲線

表1 2株肝癌細(xì)胞系中DNMT mRNA的表達(dá) (R)

表2 肝癌組織中DNMT mRNA的表達(dá)分析

討 論

至今發(fā)現(xiàn)的DNMT至少有4種亞型，分別為:DNMT1、DNMT2、DNMT3A 和 DNMT3B，主要功能是維持甲基化和全程甲基化。甲基化是在DNMT的催化作用下加到C上形成mC[4]，從理論上講應(yīng)與DNMT的結(jié)構(gòu)和/或活性異常有關(guān)。DNMT1的主要功能是保證新合成的DNA具有高度的保真性，并且維持甲基化轉(zhuǎn)移酶的功能[5]。DNMT2的作用目前尚不明確，可能與著絲粒區(qū)域的甲基化控制有關(guān)。DNMT3A和DNMT3B在原始胚胎形成中起重要的作用，主要功能是催化DNA甲基化的新生位點(diǎn)。正常細(xì)胞DNMT1的過(guò)度表達(dá)可導(dǎo)致CpG島超甲基化，促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。有研究表明，部分腫瘤細(xì)胞的DNMT水平表達(dá)明顯高于正常細(xì)胞，并且與某些抑癌基因的超甲基化狀態(tài)相關(guān)[6]。在細(xì)胞周期中不同的 DNMT mRNA可能受不同的調(diào)節(jié)機(jī)制調(diào)控，異常的DNMT表達(dá)可引起甲基化改變，且DNMT功能改變可引起異常甲基化或正常甲基化模式的丟失，導(dǎo)致DNA甲基化模式的轉(zhuǎn)換。與DNMT相關(guān)的因素可能有:(1)與DNMT1忠誠(chéng)性有關(guān);(2)與 DNMT3A和DNMT3B的錯(cuò)誤靶向有關(guān);(3)與錯(cuò)誤的甲基化修復(fù)機(jī)制有關(guān);(4)與DNMT的活性異常有關(guān);(5)與染色質(zhì)構(gòu)型重塑(chromatin remodeling)有關(guān)。

HBV感染與肝癌之間的關(guān)系十分密切，流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)肝癌患者 HBsAg陽(yáng)性率可達(dá)90%[7]。國(guó)內(nèi)外的研究也表明持續(xù)的HBV感染所導(dǎo)致的部分抑癌基因甲基化是肝癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的早期事件[3，8-9]。雖然持續(xù)的HBV感染可以導(dǎo)致部分抑癌基因的甲基化發(fā)生，但是這其中的機(jī)制尚不明確。本研究采用定量PCR檢測(cè)HBV相關(guān)性與非HBV相關(guān)性肝癌細(xì)胞系中4種DNMT mRNA表達(dá)水平的變化，探討HBV感染是否對(duì)一種或多種DNMT mRNA的表達(dá)水平產(chǎn)生影響。

在本結(jié)果中發(fā)現(xiàn)HBV感染肝癌組織和非HBV感染肝癌組織間DNMT mRNA表達(dá)水平不同。HBV感染相關(guān)肝癌組織中DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA水平明顯高于非HBV感染相關(guān)癌組織，還發(fā)現(xiàn)可分泌HBsAg的Hep3B細(xì)胞這3種 DNMT mRNA表達(dá)也高于 HBsAg陰性的HepG2細(xì)胞。上述試驗(yàn)結(jié)果表明HBV的病毒組分可以剌激受染細(xì)胞DNMT mRNA的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)抑癌基因的甲基化。甲基化酶的表達(dá)異常改變可能與基因異常甲基化和腫瘤形成有關(guān)，在多種腫瘤中均可見(jiàn)DNMT mRNA的過(guò)度表達(dá)。國(guó)內(nèi)許軍等[10]在研究人肝癌細(xì)胞株、人正常肝細(xì)胞株及癌旁細(xì)胞株中DNMT3B的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞株中DNMT3B mRNA的表達(dá)要明顯高于正常和癌旁細(xì)胞株，提示DNMT3B的高表達(dá)可能與肝癌的發(fā)生相關(guān)。

病毒感染與DNMT之間的這種關(guān)系并不只存在于肝癌細(xì)胞中。有研究表明除HBV外的其他病毒及其組分也可通過(guò)激活DNMT的活性從而進(jìn)一步使抑癌基因的表達(dá)下降。Tsai等[11]在培養(yǎng)的鼻咽癌細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)EB病毒感染的癌基因產(chǎn)物(LMP-1)能夠誘導(dǎo) DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的表達(dá)，進(jìn)而使E-cadherin基因發(fā)生甲基化。EB病毒是胃癌發(fā)生的一個(gè)潛在危險(xiǎn)因子，研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌發(fā)生過(guò)程中，DNMT1的高表達(dá)與 h-MLH、thrombospondin-1、E-cadherin等基因啟動(dòng)子甲基化和CpG島甲基化表型相關(guān)，并且這些基因的甲基化均與EB病毒感染有關(guān)[12]。HB病毒感染、DNMT活性改變、基因甲基化都是肝癌形成的早期事件，那么從某種程度上講，三者具有潛在的關(guān)聯(lián)，HBV感染作為肝癌形成的一個(gè)外部生物因子，可能通過(guò)刺激DNMT基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)抑癌基因甲基化而參與肝癌形成，這也為了解肝癌的發(fā)生機(jī)制提供了一個(gè)新的思路。

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