雞冠花離體培養(yǎng)優(yōu)化的探討

郭 麗，王存綱，王軍玲

(1．河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學院，河南 鄭州 451450;2．鶴壁職業(yè)技術學院，河南 鶴壁 458030;3．深圳市第二職業(yè)技術學校，廣東 深圳 518107)

雞冠花 (Celosia cristataL．)屬于莧科青葙屬一年生草本植物［1］。雞冠花原產(chǎn)東亞及南亞亞熱帶和熱帶地區(qū)，世界各地均有栽培。適于作一年生花卉露地栽培，矮生種也可盆栽［2］。雞冠花綠化裝飾效果強，還可做切花和干花的材料［3］，學者們多對雞冠花的藥用、食用價值進行研究［4－10］，被推測是一種很有開發(fā)利用前景的天然食藥兼?zhèn)涞墓δ苄陨刭Y源［11］。其含有豐富的營養(yǎng)素及色素，食用安全，有廣闊的開發(fā)利用價值和規(guī)?；a(chǎn)的前景。

雞冠花采用傳統(tǒng)的播種繁殖，繁殖系數(shù)低。又因異花授粉，天然雜交容易造成品種特征混雜和品種退化，逐漸失去原有價值，留種植株需要注意隔離［12］。應用組織培養(yǎng)技術則可保持原品種的特性，減少制種的麻煩，還可極大提高繁殖系數(shù)，節(jié)約成本。本文旨在探討雞冠花快速繁殖所需條件，為組培快繁體系的構(gòu)建、工廠化育苗和品種保持提供理論依據(jù)和參考價值，并為以后的遺傳轉(zhuǎn)化和倍性育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試雞冠花種子由河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學院花卉實驗室提供。

1.2 處理設計

滅菌試驗。設75%乙醇+0.1%升汞5種不同時間組合進行種子滅菌處理 (表1)，接種后及時觀察統(tǒng)計，比較各種滅菌方式的效果及苗的生長狀況。

表1 滅菌處理組合對雞冠花種子萌發(fā)的影響

激素配比試驗。切取無菌苗頂芽接入外加不同激素濃度和配比的MS培養(yǎng)基中，進行最適激素配比的篩選，共計13種處理組合 (表2);取生長相對一致的不定芽接入外加不同激素濃度和配比的MS培養(yǎng)基 (表3)。每種處理接種30個，重復3次。培養(yǎng)25 d后，觀察統(tǒng)計，篩選出最適培養(yǎng)基。

生根試驗。將生長健壯，高2～3 cm的試管苗，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上誘導不定根的產(chǎn)生。生根培養(yǎng)基采用1/2MS、MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度生長素 (表4)。每處理20株，15 d后統(tǒng)計生根率，篩選出最佳生根培養(yǎng)基。培養(yǎng)室溫度為 (25±2)℃，光照12～14 h，光照強度1 500～2 000 lx。

2 結(jié)果與分析

2.1 滅菌

外植體的滅菌效果直接影響著試驗的進程。由表1可知，滅菌時間的長短影響著滅菌效果。當升汞處理時間為6～8 min時，滅菌不徹底，存在污染現(xiàn)象;當≥10 min時，污染率為0。隨著乙醇和升汞處理時間的延長，污染率雖為0，對材料的傷害力卻逐漸增大，致使發(fā)芽時間延長2～3 d，甚至1周不等，且萌發(fā)率有所降低。結(jié)果表明，在所進行的滅菌處理中，以酒精滅菌30 s外加HgCl2(加數(shù)滴吐溫-20)滅菌10 min的處理組合最佳，即洗滌劑浸泡10 min，自來水沖洗30 min，75%乙醇漂洗30 s，0.1%的升汞滅菌10 min，無菌水沖洗4～6次，無菌率達100%，芽萌發(fā)率達100%，出芽所需時間短。而且從后期觀察中發(fā)現(xiàn)無菌苗整齊度高，生長一致。種子從滅菌之后，經(jīng)過1周左右，開始萌發(fā)，12 d左右逐漸長出真葉，當20 d后長出3～4片真葉時，即行下步試驗。

表2 激素處理組合對雞冠花初代培養(yǎng)的影響

2.2 初代培養(yǎng)

由表2可知，6-BA和NAA對雞冠花的芽誘導起著重要的作用，無任何激素的情況下，不能誘導出芽，而當加入激素后隨濃度的升高，芽的誘導率提高，平均腋芽數(shù)增多。6-BA 2.0 mg·L－1+NAA 0.20 mg·L－1處理組合增殖系數(shù)最大，為1.27。

從生長表現(xiàn)上可知，當6-BA濃度＞1.0 mg·L－1時，所形成的芽開始變小，生長表現(xiàn)不良，不利于以后的生長。從生長狀況來看，6-BA 2.0 mg·L－1+NAA 0.20 mg·L－1處理增殖系數(shù)最大，誘芽最多;6-BA 1.0 mg·L－1+NAA 0.20 mg·L－1處理則再生不定芽大，長勢好。綜合考慮則以6-BA 1.0 mg·L－1+NAA 0.20 mg·L－1為最佳的初代培養(yǎng)基。

表3 激素處理組合對不定芽繼代增殖培養(yǎng)的影響

表4 激素處理組合對雞冠花生根誘導的影響

2.3 繼代增殖培養(yǎng)

從表3看出，當單獨使用6-BA時增殖效果差，出現(xiàn)短而扁的莖，整個芽呈并生狀態(tài)，葉片不伸。隨6-BA濃度越高，葉片卷曲度更高，隨后轉(zhuǎn)接發(fā)現(xiàn)它會向花芽轉(zhuǎn)變 (圖1)，說明6-BA可能利于花芽形成。適宜的激素組合可使。

圖1 增殖培養(yǎng)中出現(xiàn)的并生芽

芽的增殖系數(shù)達到最高。通過觀察及多重比較認為，以 6-BA 1.0 mg·L－1+NAA 0.10 mg·L－1增殖系數(shù)最大，達到1.43，產(chǎn)生的不定芽長勢也最好，確定為最佳的增殖培養(yǎng)基。

2.4 生根誘導

從表4可知，IBA對生根具有重要作用，雖在無IBA情況下也能生根，但生根很少;當IBA濃度超過一定值后，隨IBA濃度的提高，有生根率降低的趨勢。以1/2MS為基本培養(yǎng)基上的生根率明顯高于以MS為基本培養(yǎng)基的生根率，產(chǎn)生的根數(shù)也多。綜合總體生根狀況，以1/2MS+IBA 0.4 mg·L－1效果最好，生根率達 95%，根多且粗壯。

2.5 煉苗與移栽

當生根培養(yǎng)基上雞冠花組培苗長到1～2 cm時，先煉苗以利其適應外界環(huán)境條件，具體做法為:不揭封口膜讓試管苗在室溫下放置2～3 d，再揭去封口膜繼續(xù)煉苗1～2 d，加少許自來水 (目的是軟化培養(yǎng)基和防止培養(yǎng)基長菌)繼續(xù)煉苗1～2 d即完成煉苗過程。然后小心取出苗子，洗去附著在根上的培養(yǎng)基，將沖洗干凈的組培苗用800倍的多菌靈溶液浸泡30 min，最后轉(zhuǎn)入含水量為70%左右的無菌營養(yǎng)土中栽培。因雞冠花為草本，葉片薄，易失水萎蔫，要特別注意覆蓋塑料薄膜保濕，5～7 d后可揭去薄膜，讓其自然生長。20 d后統(tǒng)計移栽成活率可達90%以上，而且植株生長健壯。

3 小結(jié)和討論

本試驗通過對雞冠花外植體進行離體培養(yǎng)，優(yōu)化了其再生體系。研究目的旨在指導并應用于生產(chǎn)，節(jié)約成本和適應大規(guī)模生產(chǎn)。

在植物的離體快繁中，激素是重要的調(diào)控因子。適宜的激素種類及其配比起著重要的作用。本試驗在研究雞冠花初代和繼代培養(yǎng)中，得出激素是雞冠花分化芽所必須的，否則不產(chǎn)生再生芽，在組織培養(yǎng)中，初代培養(yǎng)階段的適宜激素濃度要高于繼代階段。在生根試驗中，IBA的作用不容忽視，雖無激素基本培養(yǎng)基中雞冠花也能生根，但根量少、較細，而在添加 IBA 0.4 mg·L－1后，得到了根量多，生長好的生根苗。

采用的植物器官、部位不同，所需的激素濃度、出芽方式也不盡相同。雞冠花組培中有采用4～5 d苗齡子葉、子葉節(jié)于附加6-BA 2～3 mg·L－1+NAA 0.2 mg·L－1的 MS培養(yǎng)基上產(chǎn)生愈傷組織分化出芽進行快繁的［13］。本試驗則是采用雞冠花幼苗莖尖進行初代培養(yǎng)，以組培苗不定芽繼代培養(yǎng)，并得到不同最佳濃度組合。另外，本試驗中出現(xiàn)了并生狀態(tài)芽的情況，這可能與激素有關，因為在同樣條件下，未添加激素時，無這種情況發(fā)生，而當加入激素后才有此種現(xiàn)象出現(xiàn)，且隨激素濃度提高其出現(xiàn)頻率變大。

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