不同年齡大鼠空間學習能力的差異

葉保國 李新白 張文文 朱慶三 宋雪松 (吉林大學第一醫(yī)院麻醉科，吉林 長春 3002)

學習和記憶的分子基礎是修飾神經元突觸產生腦電活動，即突觸可塑性。神經元通過幾種形式改變突觸強度，使得長時程增強(LTP)時特異的突觸活動增強，長時程抑制(LTD)時特定的突觸活動削弱。Arc是長期記憶形成所特別需要的，并影響所有這些突觸可塑性的形式。Arc在大腦的谷氨酸能神經元表達以適應行為和學習增強的突觸活動〔1～4〕，其轉錄和蛋白質合成的定位被嚴格調控，在樹突〔5，6〕、突觸后密集區(qū)〔5，7，8〕和核〔9，10〕高度表達。通過基因敲除(KO)去除 Arc，雖然不影響短期學習，但不能形成長期記憶〔11〕。記憶無疑受衰老和疾病的影響，已研究報道在衰老的海馬Arc基因轉錄和蛋白表達水平下降，但有關幼年階段Arc與記憶能力的關系未見研究報道。本文擬了解不同發(fā)育階段影響記憶能力的基因的表達水平，以探索疾病導致突觸可塑性功能障礙的分子機制。

1 材料與方法

1.1 水迷宮 水迷宮為圓形水槽，直徑130 cm，高50 cm，池

水深32 cm，加入黑色食用色素，測試過程中使水溫保持(26±1)℃，測試過程室溫保持(20±2)℃。房間光照恒定。在水槽壁上按方位等距離、以不同形狀的剪紙標記四個點S、N、E、W，并依此順序作為放入鼠的位點，在N和W點形成的區(qū)域內距離槽壁28 cm處放置一平臺，直徑11 cm、高30 cm，使其位于水面下2 cm，并用3層白色紗布包裹縛牢，修剪整齊。在水槽正上方安置連接顯示器的攝像頭，同步記錄大鼠的移動軌跡。

1.2 主要試劑和動物 抗大鼠Arc抗體，Abgent公司;HRP標記二抗IgG，DAB顯色試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司。雄性SD大鼠，SPF級，由吉林大學實驗動物中心提供。

1.3 方法

1.3.1 Morris水迷宮實驗 取2月齡和6月齡鼠各12只作為實驗組，其余2月齡和6月齡大鼠各12只作為各自的對照組，進行水迷宮訓練。將鼠放到平臺上適應10 s取下，將大鼠隨機從不同象限面壁放入水中，觀察其能否找到平臺。若在水中轉一圈仍找不到，則引導其找到，待鼠登上平臺后10 s取下，重復上述過程一次。訓練實驗結束4 h后，進行定位航行實驗。取受訓過的鼠從規(guī)定的第一點面壁放入水中，計時鼠登上平臺的時間，為逃避潛伏期。最長記錄時間為90 s，若大鼠在90 s內不能登上平臺，其逃避潛伏期計為90 s，同時記錄大鼠在平臺象限的停留時間，即進入平臺象限到登上平臺的時間。順次從標記的4個點分別完成該過程，2次的時間間隔為15～20 min。每次實驗結束時將鼠放入保溫箱內吹干，放回鼠籠。每天如此進行定位航行實驗，共3 d。

1.3.2 免疫組化檢測大鼠海馬Arc的表達 斷頭處死大鼠，剝離海馬組織，固定、包埋、切片后，脫蠟、脫水，抗原修復后，BSA封閉2 h;滴加Arc抗體(1∶500)，37℃孵育過夜，PBS洗滌3次;滴加HRP標記的二抗(1∶1 000)，37℃孵育2h，PBS洗滌3次;DAB顯色。鏡下觀察，照相。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS16.0軟件行t檢驗。

2 結果

2.1 不同月齡大鼠在平臺象限停留時間 水迷宮實驗結果顯示，隨著入水次數的增加，2月齡和6月齡大鼠在平臺象限停留時間逐漸縮短(P＜0.05或P＜0.01)，2月齡大鼠每天每次在平臺象限停留時間比6月齡大鼠長;隨著訓練天數的增加，2月齡大鼠平臺象限停留時間明顯縮短(P＜0.01或P＜0.001)，6月齡大鼠停留時間也縮短，但無統(tǒng)計學意義至第2天、第3天6月齡大鼠停留時間已趨于穩(wěn)定，表明6月齡大鼠形成記憶能力較強，較快形成長期記憶。雖然第3天2月齡大鼠停留時間接近6月齡大鼠，但其記憶形成能力不穩(wěn)定。每天2月齡大鼠第4次入水停留時間比第3次有所升高，考慮是受方位及年齡等因素影響。見表1。

表1 2月齡、6月齡大鼠水迷宮實驗平臺象限停留時間(，S，n=12)

表1 2月齡、6月齡大鼠水迷宮實驗平臺象限停留時間(，S，n=12)

與 S點比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

時間點 S 2月齡 6月齡N E W月齡第一天 19.71±9.88 9.84±8.14 13.94±9.521) 7.03±5.94 5.55±5.551) 4.91±3.56 7.89±5.042)2月齡 6月齡2月齡 6月齡2月齡 6 4.99±5.66第二天 9.85±5.92 7.37±5.46 6.91±5.50 3.39±2.011) 2.98±1.14 4.07±5.20 3.87±3.692) 3.65±3.27第三天 5.27±4.71 2.89±1.56 3.53±1.72 3.74±3.23 2.90±1.60 3.09±2.74 5.81±3.68 5.35±7.67

2.2 免疫組化分析Arc在大鼠海馬的表達 進行行為訓練的大鼠Arc表達量高于未接受行為訓練的對照組大鼠，且接受行為訓練的6月齡大鼠Arc表達量高于2月齡大鼠。見圖2。

圖2 免疫組化檢測水迷宮實驗的2月齡和6月齡大鼠海馬Arc的表達(×100)

3 討論

大腦對外界信息的存儲和處理是通過神經元突觸相互連接形成的網絡來完成的。眾所周知，大腦長期存儲信息是依賴于快速的、從頭的RNA和蛋白的合成，分子合成是長期形成突觸可塑性如LTP和LTD必不可少的，突觸可塑性是學習和記憶的基礎。立即早期基因Arc(也稱為Arg3.1)是將行為與神經元活動信息最緊密耦聯(lián)的分子〔12〕。

Arc是高度保守的單拷貝基因，在許多種不同的行為模式均可被誘導，具有重現性。Guzowski等〔12〕應用熒光原位雜交方法檢測出5 min空間探索訓練可誘導約40%海馬CA1神經元的Arc轉錄，證實了在體內Arc可促進海馬和皮質完成學習功能。而這一區(qū)域易受到傷害進入衰老狀態(tài)，同正常衰老一樣影響記憶功能。但幼齡階段Arc的轉錄和表達水平不清楚。本文結果表明6月齡大鼠形成記憶能力較強，較快形成長期記憶。雖然第3天2月齡大鼠停留時間接近6月齡大鼠，但其記憶形成能力不穩(wěn)定，且易受方位及年齡等因素影響。免疫組化檢測結果表明不同月齡大鼠Arc的表達水平不同，其表達水平直接影響大鼠的學習、記憶形成能力。

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12 Guzowski JF，Timlin JA，Roysam B，et al.Mapping behaviorally relevant neural circuits with immediate－early gene expression〔J〕.Curr Opin Neurobiol，2005;15(5):599－606.