ECA109細(xì)胞對(duì)二甲基亞楓耐受劑量的分析

宋鳳艷 (韓山師范學(xué)院生物系，廣東 潮州 521041)

二甲基亞砜(DMSO)是一種性能優(yōu)越的溶劑，在細(xì)胞培養(yǎng)的過程中，不僅是凍存細(xì)胞的冷凍劑，也是很多干預(yù)藥物的常用載體［1］。一些研究表明，DMSO本身具有誘導(dǎo)癌癥細(xì)胞分化、抑制生長和促進(jìn)凋亡的作用［2-4］。在藥理研究過程中，DMSO作為藥物溶劑，控制好使用劑量，以免對(duì)藥物自身的作用產(chǎn)生干擾就顯得很重要。本研究以ECA109細(xì)胞株為對(duì)象，通過觀察不同濃度DMSO干預(yù)下，細(xì)胞形態(tài)及生存率的變化，確定上述細(xì)胞株對(duì)該試劑的耐受劑量，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用提供研究支持。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象:ECA109細(xì)胞株。

1.2 主要試劑:二甲基亞砜(DMSO)，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)，DMEM高糖培養(yǎng)基，胰蛋白酶，胎牛血清，溴化乙錠(EB)，吖啶橙(AO)，上述試劑購自Sigma公司。

1.3 主要儀器:CO2培養(yǎng)箱(HE2RA cell150，Thermo公司)，超凈工作臺(tái)(Thermo公司)，倒置相差顯微鏡(Olympus BH-5，Olympus公司)，MC顯微數(shù)碼成像系統(tǒng)(廣州市明美光電技術(shù)有限公司)，酶標(biāo)儀(AD 340，Beckmann Coul2ter)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng):分別取對(duì)數(shù)期生長的ECA109細(xì)胞株，胰酶消化后用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋為單細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度約為2×104/L。各以200 μl/L孔和1 ml/孔的劑量接種于96孔培養(yǎng)板和24孔培養(yǎng)板，在體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2和37℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.5 DMSO的干預(yù):當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)滿24 h時(shí)，按照10個(gè)濃度梯度(2 ml/L、4 ml/L、6 ml/L、8 ml/L、10 ml/L、12 ml/L、14 ml/L、16 ml/L、18 ml/L、20 ml/L)依次加入預(yù)處理好的DMSO試劑，每個(gè)濃度梯度對(duì)應(yīng)4個(gè)培養(yǎng)孔，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.6 MTT檢測(cè):干預(yù)后的24 h、48 h和72 h，分別取一塊96孔板，小心吸出各孔培養(yǎng)液，再向各孔內(nèi)加入無血清DMEM高糖培養(yǎng)基1 ml和5 g/L的MTT試劑10 μl，混合均勻，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。4 h后小心吸出培養(yǎng)液，向每個(gè)培養(yǎng)孔內(nèi)加入純凈的DMSO試劑200 μl，震蕩溶解20 min。以空白對(duì)照孔(無細(xì)胞)調(diào)零，在酶標(biāo)儀上測(cè)定記錄各孔吸光度值(490 nm)，計(jì)算各個(gè)濃度對(duì)應(yīng)的細(xì)胞生存率。

1.7 細(xì)胞形態(tài)觀察:干預(yù)后的24 h、48 h和72 h，分別取一塊24孔板，AO/EB染色前后分別置于光學(xué)相差顯微鏡下，觀察拍照記錄細(xì)胞的形態(tài)變化。

2 結(jié)果

2.1 DMSO作用于ECA109細(xì)胞株后細(xì)胞生存率及IC50的計(jì)算結(jié)果:從圖1可以看出，隨著加入DMSO劑量的增加和作用時(shí)間的延長，該試劑對(duì)細(xì)胞的抑制作用逐漸明顯。對(duì)ECA109細(xì)胞而言，8 ml/L濃度作用24 h時(shí)細(xì)胞生存率變化尚不明顯，48 h時(shí)則有近10個(gè)百分點(diǎn)的下降，72 h時(shí)下降幅度已有20%。隨著濃度的提高和作用時(shí)間的延長，DMSO對(duì)細(xì)胞生存率的影響明顯加大，10 ml/L濃度作用24 h時(shí)細(xì)胞生存率下降已達(dá)10%。另外，對(duì)24～72 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的結(jié)果彼此進(jìn)行比較，差別都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05)。

圖1 DMSO作用于ECA109:細(xì)胞株后24～72 h細(xì)胞生存率檢測(cè)結(jié)果

2.2 DMSO作用于ECA109細(xì)胞株后24～72 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)的IC50計(jì)算結(jié)果:由圖3可以看出，ECA109細(xì)胞在24～72 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)的IC50(50%inhibiting concentration)值呈逐漸降低的趨勢(shì)，24 h時(shí)為17.34 ml，48 h時(shí)為13.7 ml，而72 h時(shí)只有11.24 ml。

2.3 DMSO作用于ECA109細(xì)胞株后細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化:圖3(圖片a～f)是12 ml/L濃度的DMSO作用于ECA109細(xì)胞48 h后，倒置相差顯微鏡下觀察到的多種細(xì)胞形態(tài)。從圖中可以看出，正常ECA109細(xì)胞(圖片a)呈現(xiàn)不規(guī)則的形狀，細(xì)胞邊界清晰，外觀近似梭形。受DMSO干預(yù)后(圖片b～f)，細(xì)胞發(fā)生收縮，體積變小，外形逐漸變圓，變形后的細(xì)胞聚集成團(tuán);部分細(xì)胞裂解，出現(xiàn)疑似凋亡小體的形態(tài)特征。

圖片a1～f1是ECA109細(xì)胞經(jīng)AO/EB染色后的影像特征，a1為對(duì)照組細(xì)胞，正常ECA109細(xì)胞外形不規(guī)則，有的呈多邊形，有的近似梭形，細(xì)胞及細(xì)胞核邊界清晰，染色均勻。b1～f1是12 ml/L濃度的DMSO干預(yù)后處在不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞。從圖中可以看出，細(xì)胞的胞質(zhì)逐漸脫落，細(xì)胞收縮變圓，體積逐漸縮小，細(xì)胞核深染。AO/EB染色后，呈現(xiàn)不同程度的橘黃色和橘紅色熒光(藍(lán)色光激發(fā))。細(xì)胞核邊界逐漸模糊直至消失，最后細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)融合。

圖2 DMSO作用于ECA109后24～72 h對(duì)應(yīng)的IC50計(jì)算結(jié)果

圖3 EDTA-Na作用于ECA109:細(xì)胞株48 h時(shí)觀察到的細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征(a為對(duì)照組細(xì)胞，b～f是未染色時(shí)倒置相差顯微鏡下觀察到的ECA109細(xì)胞;a1是對(duì)照組細(xì)胞，b1～f1是AO/EB染色后的ECA109細(xì)胞)

3 結(jié)論

DMSO具有細(xì)胞毒性低、細(xì)胞膜親和力高的特點(diǎn)，在一定的劑量范圍內(nèi)是比較理想的藥物溶劑。綜合本次的研究結(jié)果，可以得出以下結(jié)論:對(duì)于ECA109細(xì)胞而言，24 h內(nèi)8 ml/L的濃度對(duì)細(xì)胞基本沒有影響，作用時(shí)間如需延長至48～72 h，劑量最好控制在6 ml/L左右;DMSO對(duì)癌癥細(xì)胞生長的影響具有劑量依賴性和時(shí)間依賴性，不同種類的癌癥細(xì)胞對(duì)該物質(zhì)的耐受性有所不同［5］，目前關(guān)于該方面的研究還非常有限，進(jìn)一步的研究還很必要。

［1］ Melkonyan H，Sorg C，Klempt M.Elect reparation efficiency in mammalian cells is increased by dimethyl sulfoxide(DMSO)［J］.Nucleic Acids Research，1996，2(21):4356.

［2］ Koike M，Ishino K，Kohno Y，et al.DMSO induces apoptosis in SV402 transformed human keratin ocytes，but not in normal keratin ocytes［J］.Cancer Lett，1996，108(2):185.

［3］ 劉曉琴，郭 峰，張艷麗 .二甲基亞砜通過激活caspase23以及抑制PARP21引起A549細(xì)胞凋亡［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2010，30(6):566.

［4］ 譚立軍，湯雪明.二甲基亞砜誘導(dǎo)人食管癌細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究［J］. 實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報(bào)，1998，31(4):353.

［5］ 吳 迪，巴哈爾古麗·卡哈爾，吳桂榮.溶媒二甲基亞砜對(duì)細(xì)胞生長與活力的影響研究［J］.新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，33(5):489.