人臍帶間充質干細胞源性心肌細胞的純化及生物學特性鑒定

汪 濤 林曉波 吳 毅 陳曉東 馬桂霞 賀谷雨 蔡志偉 劉必剛 秦 山馬 廉，

目前心肌梗死、心力衰竭等心血管疾病的干細胞治療已逐漸開展，并取得了一定的效果。心肌病是兒童期嚴重的疾病，預后較差，存活者常伴有持久的心肌損害和心功能不全，目前尚無確切有效的治療方法，干細胞移植可能成為兒童心肌病治療的一個新希望。但用于心臟疾病移植的成體干細胞是非心臟源性的，其向心肌細胞、內皮細胞分化的數(shù)量很少，不能滿足心肌重建的需要。尋找一種多潛能的心血管干/祖細胞，提高其分化率是突破目前干細胞移植治療心血管疾病“瓶頸”的重要環(huán)節(jié)。人臍帶間充質干細胞( MSCs) 具有多向分化潛能，且干細胞含量多，取材方便，因而有必要探討人臍帶MSCs 來源的心肌細胞的純化及功能，為心臟細胞移植尋找一種新的干細胞來源。

1 方法

1.1 倫理和知情同意 本研究新生兒臍帶的取材得到新生兒家屬的同意。

1.2 材料 新生兒臍帶取自汕頭大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院出生的正常新生兒。DMEM 培養(yǎng)基( GIBCO 公司) ，胎牛血清( FBS，GIBCO 公司) ，抗體肌鈣蛋白Ⅰ( troponin Ⅰ) 、結蛋白( desmin) 及人心肌球蛋白輕鏈( MLC-2v) ( 上海酶聯(lián)生物科技有限公司) ，pMLC2v-EGFP 質粒( GeneCopoeia 公司合成，含嘌呤霉素抗性基因) ，5-氮雜胞苷( 5-aza，Sigma公司) ，ABC 試劑盒( Thermo Scientific) ；山羊抗兔IgG 異硫氰酸熒光素抗體( Bethyl，USA) ，Trizol( Invtrogen 公司) ，引物由深圳華大基因公司合成，RT-PCR 試劑盒( TaKaRa 公司) ，轉染試劑盒( Roche) 。

1.3 MSCs 的培養(yǎng)和鑒定 方法參見文獻［1］，主要步驟簡述如下。

1.3.1 細胞培養(yǎng) 取新生兒臍帶一條，去表皮、臍動脈及臍靜脈，取華爾通氏膠( Wharton's jelly) ，剪切為1 ～2 mm3的組織塊，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)液為DMEM 培養(yǎng)基。新生細胞呈貼壁生長，待細胞生長至融合80% ～90%時傳代。用0.125%的胰蛋白酶37℃消化3 ～5 min 后終止消化，收集細胞，將細胞接種至25 cm2培養(yǎng)瓶，繼續(xù)用含10%FBS 的DMEM 細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。

同批細胞分成實驗組和對照組，實驗組細胞進行質粒轉染、篩選和5-aza 誘導；對照組細胞不進行質粒轉染、篩選和5-aza 誘導，僅用培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3.2 質粒pMLC2v-EGFP 轉染MSCs 及進行篩選 將人臍帶MSCs 傳代至6 孔板，待細胞生長融合至密度占培養(yǎng)板面積的70% ～80%進行轉染，轉染前1 d 細胞換新的DMEM 培養(yǎng)基。轉染步驟：取2 mL EP 管，加入200 μL 無血清DMEM，再加入2 mg pMLC2v-EGFP 質粒，輕輕混勻，再加入6 mL X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent，輕輕混勻，靜置15 ～20 min；將上述轉染液加至準備好的一孔細胞中，放入37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 ～48 h 后，1∶3傳代，加入1 μg·mL-1嘌呤霉素篩選液篩選2 周。轉染后48 h 熒光顯微鏡下觀察細胞是否有綠色熒光蛋白表達。

1.3.3 體外誘導 將轉染及篩選后人臍帶MSCs 在生長融合達60% ～70%時，更換培養(yǎng)液，加入10 μmol·L-15-aza( 不含F(xiàn)BS)［2］誘導劑，24 h 后吸去5-aza 誘導液，換為含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至28 d。誘導期間用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化。

1.3.4 誘導后心肌細胞的免疫熒光染色 將誘導后心肌細胞爬片，PBS 清洗，4%多聚甲醇固定20 min，PBS 清洗3 min× 3 次，加入0.1%Triton-X 透化15 min，PBS 清洗3 min× 3 次，加1%BSA 封閉液30 min ，滴加1 抗( troponin I、desmin 及MLC2v) 稀釋度均為1∶200，4°C 過夜，PBS 清洗2 min× 3 次，滴加山羊抗兔IgG 異硫氰酸熒光素抗體( 稀釋度為1∶200)1 h，避光操作；PBS 洗滌后用0.1 μg·mL-1PI 復染。PBS 洗滌后，封片后熒光顯微鏡下觀察，結果拍照留底。

1.3.5 RT-PCR 檢測誘導后心肌細胞標記物Desmin 和Nkx2.5 表達 提取對照組和實驗組細胞總RNA，逆轉錄得到cDNA。正反引物及擴增產(chǎn)物的長度如下： β-actin 引物F：5'-CACACTGTGCCCATCTACGA-3'，R：5'-TACAGGTCTTTGCGGATGTC-3'(400 bp) 。Desmin 引物F：5'-ACCGCTTCGCCAACTACATC-3'； R： 5'-TCACTGGCAAATCGGTCCTC-3'(727 bp) 。Nkx2. 5 引 物F：： 5'-GGAGAAGACAGAGGCGGACA-3'；R：5'-ACGCCGAAGTTCACGAAGTT-3'(525 bp) 。擴增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳顯影，照相分析結果。

2 結果

2.1 人臍帶來源干細胞的原代培養(yǎng) 人臍帶華爾通氏膠小塊組織在培養(yǎng)液中培養(yǎng)，5 ～7 d 后可見新生細胞，細胞呈貼壁生長，形狀多為長條狀或多角形，分布不均( 圖1A) 。原代細胞培養(yǎng)10 ～14 d 進行傳代，傳代后在本實驗條件下3 ～5 d 細胞增殖4 ～5 倍，再次傳代，體外培養(yǎng)10 代以上，細胞增殖速度在9 代后有所減緩，細胞形態(tài)較寬大，且不規(guī)則( 圖1B) 。

圖1 人臍帶間充質干細胞Fig 1 Human umbilical cord mesenchymal stem cells

2. 2 人臍帶MSCs 篩選 加入嘌呤霉素篩選2 周，可見未轉染進質粒的細胞死亡脫落，轉染成功的細胞繼續(xù)貼壁生長，未受嘌呤霉素影響。熒光顯微鏡下觀察存活細胞可見綠色熒光，表明質粒成功轉染進人臍帶MSCs，穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白( 圖2A) 。

2.3 人臍帶來源的MSCs 向心肌細胞分化 顯微鏡下可見實驗組細胞體積逐漸增大，較多桿狀細胞，少量的多變形等不規(guī)則形態(tài)，胞漿內條紋樣結構，培養(yǎng)4 周后細胞逐漸融合并相互連接形成肌管樣結構；對照組細胞多為梭形，體積較小，有少量的桿狀細胞，單核。兩組未觀察到分化細胞的自發(fā)跳動。

2.4 經(jīng)5-aza 誘導后心肌細胞標記的免疫熒光檢測MSCs 經(jīng)轉染及篩選，再經(jīng)5-aza 誘導后，熒光顯微鏡下可見誘導后細胞均表達心肌細胞的標記物desmin( 圖2B) 、troponin Ⅰ( 圖2C) 和MLC-2v( 圖2D) ，而未經(jīng)轉染及誘導的細胞檢測結果為陰性( 圖2E、F、G) 。

2.5 RT-PCR 檢測結果 轉染及誘導前人臍帶MSCs Nkx2.5 和desmin RT-PCR 檢測結果為陰性，經(jīng)轉染及5aza誘導后，細胞的Nkx2.5 和desmin 檢測結果呈陽性( 圖3A、B) 。

圖2 轉染篩選后和誘導后細胞免疫熒光染色所見Fig 2 After transfection，screening，and induction the results of immune fluorescent staining

圖3 Nkx2.5 和desmin RT-PCR 擴增產(chǎn)物瓊脂糖電泳Fig 3 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR amplifying products of Nkx2.5 and desmin

3 討論

隨著多篇重要文獻對成體干細胞橫向分化能力的質疑［3～5］，以及胚胎干細胞存在倫理爭議，因此，MSCs 因其特有的優(yōu)勢受到國內外研究者的重視。由于MSCs 具有一定的向心肌細胞分化的可塑性，同時易于取材和體外擴增，自體移植無免疫排斥和倫理問題，因此，對MSCs 移植治療心肌梗死應用研究的探索近年來發(fā)展較快。2001 年德國Strauer 等［6，7］首次將MSCs 應用于心肌梗死的移植治療，使患者的心功能得到改善，隨后又證實MSCs 應用于臨床治療是安全和有效的。近年來國際上很多研究團隊致力于MSCs 的心臟移植治療試驗［8～10］。

2003 年Mitchell 等［11］發(fā)現(xiàn)人臍帶華爾通氏膠來源的基質細胞具有多能干細胞特性，之后對華爾通氏膠來源的人臍帶MSCs 的認識和利用取得了很大的進步［12～14］，與人胚胎干細胞( hESC) 、骨髓間充質干細胞( BMSC) 相比，人臍帶MSCs 具有明顯的優(yōu)勢： ①成本較低，來源豐富； ②不會給捐獻者造成新的創(chuàng)傷和痛苦；③不涉及倫理問題；④人臍帶MSCs 是一種較為原始的干細胞，具有極強的可塑性；⑤與BMSC 相比具有更強的擴增能力； ⑥無致瘤活性和低免疫原性；⑦與BMSC 相比，不會隨著傳代次數(shù)增加和機體年齡增長導致增殖能力和分化能力降低。因此，人臍帶MSCs將可能成為心臟細胞移植的重要細胞來源。

如何將人臍帶MSCs 誘導成為能夠用于臨床心臟移植的心肌細胞? 總結目前各種研究報道，誘導方法主要有3種：①體外分化研究，在體外藥物誘導的模型中，去甲基化藥物5-aza、成纖維樣生長因子、血小板源性生長因子B 或條件培養(yǎng)基刺激誘導都是常用的體外誘導MSCs 向心肌細胞分化的方法［2，15，16］。Wang 等［17］發(fā)現(xiàn)人臍帶華爾通氏膠來源的MSCs 與臍帶血MSCs 表型相似，在5-aza 的作用下或者與心肌細胞共同培養(yǎng)的條件下能分化為具有心肌細胞標記物( N-cadherin 和troponin Ⅰ) 的細胞。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，人臍帶華爾通氏膠來源的MSCs 經(jīng)5-aza 和DMSO 各自誘導后，能夠向心肌細胞分化，表達心肌細胞標記物［18］。②用原代培養(yǎng)的心肌細胞與MSCs 共培養(yǎng)方法證實，原代培養(yǎng)心肌細胞與MSCs 接觸是促進MSCs 向心肌樣細胞分化的重要因素，兩種細胞間接觸通訊，從而使MSCs 可能接受了向心肌方向定向分化的某種特異性信號［19，20］。③體內誘導分化，研究發(fā)現(xiàn)，MSCs 移植治療心肌梗死，可以促進功能血管的形成，減少心肌細胞的凋亡，防止了梗死擴展［21］； 同時由于新生的心肌組織改變了心肌梗死后的瘢痕形成進程，從而抑制左室重構的發(fā)生［22］，減輕了左室擴張［5］，極大地改善心功能。但以上誘導方法不能得到完全純化的組織特定細胞是其主要的障礙，因此，如何純化人臍帶MSCs 來源的心肌細胞對于臨床移植治療具有重要的意義。

本研究在前期工作的基礎上，采用細胞捕捉方法，將MLC-2v 基因啟動子與嘌呤霉素抗性基因融合，轉染于人臍帶MSCs，通過嘌呤霉素篩選，純化培養(yǎng)出MLC-2v 陽性細胞。5-aza 是胞嘧啶核苷的一個類似物，可引起DNA 中某些胞嘧啶的低甲基化，從而參與激活表型特異性的基因。這些基因在甲基化狀態(tài)下含有一個肌源性決定部位，處于轉錄失活狀態(tài)，用5-aza 誘導后，該部位去甲基化，轉錄激活，引起細胞向心肌源性細胞分化［23］。本研究將純化培養(yǎng)出MLC-2v 陽性細胞經(jīng)5-aza 誘導，誘導后細胞通過免疫熒光檢測均表達心肌細胞標記物desmin、troponin Ⅰ和MLC-2v；Nkx2.5 是與心肌細胞分化密切相關的早期轉錄因子，本研究應用RT-PCR 技術測定分化的心肌樣細胞有早期轉錄因子Nkx2.5 的表達。同時也檢測到desmin 的表達，而誘導前的細胞均沒有表達Nkx2.5 和desmin，較大提高誘導的成功率，得到相對純化的心肌樣細胞，可為臨床心臟疾病的細胞移植治療提供重要的細胞來源奠定實驗基礎。

通過基因修飾方法得到的心肌樣細胞用于移植治療仍有很多基礎及臨床問題需要解決，如通過基因修飾方法得到的心肌樣細胞能否有心肌細胞的功能，移植到宿主后能否繼續(xù)存活并改善心功能，這些方面還需要進一步實驗研究。

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