大孔吸附樹脂純化玉米須皂甙的工藝研究

關(guān)海寧，刁小琴

(綏化學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，黑龍江綏化152061)

玉米須為禾本科玉蜀黍?qū)僦参镉衩椎幕ㄖ椭^，是中國傳統(tǒng)的中藥材［1］。我國是產(chǎn)玉米的大國，玉米須資源相當(dāng)豐富，以往人們對(duì)玉米須開發(fā)利用非常有限，大部分被白白浪費(fèi)。近年來，人們開始重視玉米須資源的開發(fā)，但大部分研究都集中在對(duì)玉米須多糖、黃酮的分離純化方面［2］，而對(duì)于能有效抑制血小板凝聚、抑制腫瘤細(xì)胞的增長、防止動(dòng)脈粥樣硬化、抑制血清中的脂質(zhì)氧化、提高免疫力和平衡體重［3］的功能成分皂甙的分離純化研究少有報(bào)道。大孔樹脂具有表面積大、吸附力強(qiáng)、交換速度快和易解吸等優(yōu)點(diǎn)，因此在富集純化植物有效成分方面顯示出特殊的功能［4］。皂甙的甙元部分能被非極性樹脂所吸附，且皂甙分子較大，因此可用大孔樹脂對(duì)皂甙進(jìn)行純化工藝研究。本實(shí)驗(yàn)以玉米須為原料，以玉米須中的活性成分皂甙為出發(fā)點(diǎn)，選擇AB-8、D101兩種大孔吸附樹脂對(duì)粗皂甙進(jìn)行純化，研究大孔吸附樹脂對(duì)玉米須皂甙的靜態(tài)與動(dòng)態(tài)的吸附和解吸特征，篩選出最佳吸附劑，并對(duì)其動(dòng)態(tài)吸附特性進(jìn)行探索，目的是為提高玉米須皂甙的純度，同時(shí)該研究對(duì)開發(fā)利用玉米須資源，提高農(nóng)副產(chǎn)品的利用水平，為開發(fā)天然的植物保健食品具有一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

AB-8大孔吸附樹脂、D101大孔吸附樹脂 江蘇省臨海樹脂科技有限公司;標(biāo)準(zhǔn)齊墩果酸(純度98.38%)陜西慧科植物開發(fā)有限公司;乙醇、香草醛、高氯酸、冰醋酸等均為分析純。

Φ1.6×50耐壓型層析柱、HL-2恒流泵、BSZ-100自動(dòng)部分收集器、HD-A電腦采集儀、DZ-21-1核酸蛋白檢測(cè)儀 上海青浦滬西儀器廠;TU-1901紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司;THZ-82水浴恒溫振蕩器 天津市泰斯特儀器有限公司;FD-27冷凍干燥機(jī) 北京德天佑科技發(fā)展有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的制備 玉米須粉與乙醇溶液混合，經(jīng)超聲提取，離心分離后取上層清液，減壓蒸餾得濃縮液，再經(jīng)正丁醇萃取，取上層液，經(jīng)減壓蒸餾得褐色稠狀物，經(jīng)甲醇溶解，再加入10倍體積丙酮經(jīng)離心分離得到的沉淀物烘干稱重即為粗皂甙［5］。

1.2.2 最大吸收波長的確定 精密稱取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品13.8000mg，加甲醇溶解，定容至50mL，得到濃度為0.276μg/μL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液200、300μL分別于具塞試管中，70℃水浴上蒸干，于每個(gè)試管中加新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2mL，高氯酸0.8mL，置60℃水浴上加熱15min，流水冷卻，加冰醋酸5mL，搖勻，以 TU-1901紫外可見分光光度計(jì)在450～700nm范圍進(jìn)行間隔1nm的掃描操作，得出齊墩果酸的甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液在波長550nm有特征吸收峰。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、50、100、200、300、400、500μL 分別于具塞試管中，70℃水浴上蒸干，于每個(gè)試管中加新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2mL，高氯酸0.8mL，置60℃水浴上加熱15min，流水冷卻，加冰醋酸5mL，搖勻［6-7］，以分光光度法在550nm波長條件下測(cè)定吸光值，得標(biāo)準(zhǔn)回歸方程y=0.0057x+0.0165，相關(guān)系數(shù)R2=0.9960，線性相關(guān)性良好。

1.2.4 大孔吸附樹脂型號(hào)的選擇

1.2.4.1 大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附、解吸實(shí)驗(yàn) 單位質(zhì)量樹脂吸附的皂甙量直接影響生產(chǎn)成本，本實(shí)驗(yàn)稱取已處理好的AB-8、D101大孔吸附樹脂各1.0g，置100mL錐形瓶中，分別加入相同濃度的玉米須粗皂甙溶液20mL，在水浴恒溫振蕩器中振蕩24h，使樹脂達(dá)到飽和吸附，取上層液測(cè)定玉米須皂甙的含量，得出吸附率。為保證有效成分最大限度的回收，不僅要考察樹脂的吸附量，同時(shí)還需考察其解吸率。將上述過濾所得的吸附樹脂，吸干表面水分，分別用20mL 60%乙醇轉(zhuǎn)移至100mL錐形瓶中，振蕩24h，使解吸完全，過濾后測(cè)定玉米須皂甙含量，得出解吸率。吸附率(%)=(SS0-SS)/SS0×100，其中 SS0:未加入吸附樹脂時(shí)樣液中皂甙的含量(mg);SS:吸附后濾液中皂甙的含量(mg)。解吸率(%)=SS1/(SS0-SS)×100，其中SS1:解吸后濾液中皂甙的含量(mg)。

1.2.4.2 大孔吸附樹脂靜態(tài)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn) 按1.2.4.1的方法，每30min取樣300μL，測(cè)定各樹脂樣液在不同時(shí)刻(共計(jì)5h)的吸光值，繪制靜態(tài)吸附、解吸動(dòng)力學(xué)曲線。

1.2.5 大孔吸附樹脂動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 洗脫流速的選擇 將處理好的樹脂濕法裝柱，將2mg/mL的粗皂甙溶液上柱，控制流速0.5、1BV/h進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，分管收集流出液(每管收集10mL)，根據(jù)黃賢校等人［8］研究表明皂甙的乙醇溶液在209nm處存在一個(gè)特征吸收峰，因此通過測(cè)定其紫外條件下的吸光值，描繪洗脫過程吸光值的變化曲線，從而選擇較好的洗脫流速。

1.2.5.2 洗脫溶媒的選擇 濕法裝柱，先用2BV的去離子水去雜，分別依次用40%、50%、60%、70%乙醇以上述所得的最佳流速進(jìn)行洗脫，每管收集10mL，于550nm處以香草醛-高氯酸法測(cè)定其吸光值，繪制動(dòng)態(tài)洗脫曲線。

1.2.6 最佳條件制備產(chǎn)品 取樣品粉末用適量蒸餾水溶解(樣品濃度為2.0mg/mL)后上D101大孔吸附樹脂柱靜態(tài)吸附30min，然后先以蒸餾水洗脫至無色，再用50%乙醇溶液洗脫玉米須皂甙(流速為0.5BV/h)，收集洗脫液減壓濃縮后真空冷凍干燥成粉末。按香草醛-高氯酸法在550nm處測(cè)定吸光值，根據(jù)回歸曲線方程求得總皂甙含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔吸附樹脂類型確定

通過靜態(tài)吸附率與解吸率來確定樹脂能力的強(qiáng)弱，選出皂甙純化過程的最佳樹脂類型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 兩種大孔吸附樹脂的吸附率和解吸率Table 1 Adsorption and desorption rate of two macroporous resins

樹脂的吸附率、解吸率均高的樹脂為最佳選擇。從表1可以看出，大孔吸附樹脂D101的吸附率和解吸率均高于AB-8。但在有充分時(shí)間吸附的情況下，有些樹脂可能具有相近的飽和吸附量，由于各樹脂物理和化學(xué)結(jié)構(gòu)的差異，其吸附動(dòng)力學(xué)過程是有差異的。因此，通過實(shí)驗(yàn)比較了兩種樹脂的吸附動(dòng)力學(xué)與解吸動(dòng)力學(xué)，結(jié)果如圖1、圖2所示。

圖1 大孔樹脂靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線Fig.1 The static adsorption dynamics curve of macroporous resin

圖2 大孔樹脂靜態(tài)解吸動(dòng)力學(xué)曲線Fig.2 The static desorption dynamics curve of macroporous resin

由圖1看出，兩種樹脂起始階段吸附量(吸光值下降較快)都較大，隨著吸附時(shí)間的延長，兩種樹脂的吸附量逐漸降低，但整個(gè)吸附過程中D101的吸附量始終優(yōu)于AB-8，且二者均在4～5h基本達(dá)到平衡。由圖2得出，兩種樹脂對(duì)玉米須皂甙解吸速率有一定的差異，整個(gè)解吸過程中，D101型大孔樹脂比AB-8型大孔樹脂的解吸能力要強(qiáng)(吸光值較高)，同等時(shí)間內(nèi)的解吸量大。因此選擇D101樹脂作為分離純化玉米須皂甙的媒質(zhì)，進(jìn)行后續(xù)動(dòng)態(tài)純化研究是最為理想的。

2.2 洗脫流速的選擇

通過測(cè)定大孔樹脂在紫外條件下的吸光值，描繪洗脫過程吸光值的變化曲線，從而選擇較好的洗脫流速，結(jié)果見圖3。

圖3 不同流速的洗脫曲線Fig.3 Elution curves of different velocity

洗脫流速影響溶質(zhì)向樹脂表面的擴(kuò)散，進(jìn)而影響洗脫效果。如果流速過大，溶質(zhì)還來不及擴(kuò)散到樹脂表面，就流出了吸附柱，造成泄漏使吸光值偏低，達(dá)不到有效的分離;如果洗脫流速過低，耗時(shí)增加，效率降低，同時(shí)一定程度上造成試劑的浪費(fèi)。通過圖3可以看出，流速在0.5BV/h的洗脫條件下，能夠呈現(xiàn)出不同的洗脫峰值，洗脫分離效果較為理想。

2.3 洗脫溶媒的選擇

圖4中1～14號(hào)為40%乙醇洗脫液，15～28號(hào)為50%乙醇洗脫液，29～35號(hào)為60%和70%乙醇洗脫液。由圖可以看出，玉米須皂甙主要集中在40%的乙醇洗脫液中，但40%乙醇洗脫液不能完全洗脫玉米須皂甙。50%乙醇洗脫液能把剩余的總皂甙全部洗脫，繼續(xù)加入60%和70%的高濃度乙醇，洗脫液總皂甙含量無明顯變化。因此從生產(chǎn)成本及洗脫效率等方面綜合考慮，確定以50%乙醇作為玉米須皂甙成分的洗脫溶媒。

圖4 不同濃度洗脫溶劑的洗脫曲線Fig.4 Elution curve of different solvent concentration

2.4 最佳條件制備產(chǎn)品

按香草醛-高氯酸法在550nm處測(cè)定吸光值，根據(jù)回歸曲線方程求得總皂甙含量，與未純化的粗皂甙進(jìn)行比較，結(jié)果見表2。

表2 純化前后皂甙含量及純度對(duì)比Table 2 Comparion of saponin content and purity

由表2可知，D101型大孔吸附樹脂能提高玉米須總皂甙的純度，純度提高了3.1倍。但就其純度來講，并未達(dá)到較高的水平，因此可進(jìn)一步采用其它除雜及純化手段進(jìn)行后續(xù)研究。

3 結(jié)論

根據(jù)兩種大孔吸附樹脂的吸附率及解吸率比較，得出大孔吸附樹脂D101的吸附率和解吸率均高于AB-8。通過對(duì)D101樹脂動(dòng)態(tài)吸附特性的研究，結(jié)果表明以2BV去離子水除雜后50%乙醇為洗脫溶劑，以0.5BV/h流速進(jìn)行洗脫，效果良好。優(yōu)化工藝條件下制備產(chǎn)品的純度提高了3.1倍。

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