食源性致病菌焦磷酸通用引物測(cè)序方法的建立

趙新，王永，蘭青闊，陳銳，朱珠，余景會(huì)，李歐靜，郭永澤

（天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，天津 300381）

食品安全是人們近年來(lái)較為關(guān)注的話題，而食源性致病菌是誘發(fā)食品安全問(wèn)題的重大因素之一。因而，建立一種準(zhǔn)確快速的檢測(cè)致病菌的方法一直是研究的熱點(diǎn)[1-2]。傳統(tǒng)的鑒定方法繁瑣費(fèi)時(shí)，將細(xì)菌分離培養(yǎng)與PCR及雜交探針、基因芯片等技術(shù)手段相結(jié)合[3-4]，具有耗時(shí)短、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，但無(wú)法得到目的基因序列信息，存在假陽(yáng)性的偏差，且多需進(jìn)行凝膠電泳。

焦磷酸測(cè)序（Pyrosequencing）技術(shù)是新一代DNA序列分析技術(shù)，該技術(shù)無(wú)需進(jìn)行電泳，DNA片段也無(wú)需熒光標(biāo)記，從而能夠真正達(dá)到快速、準(zhǔn)確的鑒定病原微生物的目的，且操作極為簡(jiǎn)便[5]。

選取食源性致病菌中較為常見(jiàn)和典型的4種致病菌（沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌），利用16SrRNA高度保守區(qū)序列和可變區(qū)序列設(shè)計(jì)一組通用引物，同時(shí)檢測(cè)和鑒定4種致病菌，經(jīng)驗(yàn)證得到與國(guó)標(biāo)方法一致的檢測(cè)結(jié)果，可用于食源性致病菌的快速檢測(cè)和鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株

乙型副傷寒沙門氏菌CMCC（B）50094、甲型副傷寒沙門氏菌CMCC（B）50433、鼠傷寒沙門氏菌CMCC（B）50013、痢疾志賀氏菌 CMCC（B）51592、福氏志賀氏菌 CMCC（B）51571、鮑氏志賀氏菌 ATCC 9207、金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003、單增李斯特氏菌CMCC（B）54002共8株常見(jiàn)的危害人和動(dòng)物的食源性致病菌，均為本室購(gòu)買標(biāo)準(zhǔn)菌株。菌株復(fù)蘇后接種于相應(yīng)的增菌培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑和儀器

特異性擴(kuò)增引物和測(cè)序引物：上海生工合成；Go－TaqRMaster Mix溶液：Promega公司；Sepharose Bead、binding buffer、Annealing Buffer、底物、酶和 A、C、G、T四種堿基：Biotage公司；定量遺傳分析儀：基因有限公司；PCR擴(kuò)增儀：ABI Veriti及ABi 2720；凝膠電泳設(shè)備：BIO－R AD Power200；凝膠成像系統(tǒng)：SYNGENE 公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成

通過(guò)基因庫(kù)數(shù)據(jù)檢索網(wǎng)站 NCBI、KEGG和ClustalW程序分別對(duì)沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌的16SrR NA保守序列進(jìn)行同源性分析，尋找適合的通用測(cè)序序列[6]；再應(yīng)用焦磷酸測(cè)序儀配套專業(yè)軟件設(shè)計(jì)適合沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌的焦磷酸測(cè)序通用擴(kuò)增和測(cè)序引物。

1.2.2 細(xì)菌DNA的提取

取選擇性增菌后菌液100 μL，100℃煮菌10 min，立即－20℃，冰浴10 min，微型離心機(jī)離心 2 min～3 min，上清極為細(xì)菌DNA模板，備用。

1.2.3 PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序

擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為50 μL，其各種成分分別為：2×GoTaqRMaster Mix 25 μL，10 μmol/L 引物各 1 μL，模板 DNA 2 μL，用滅菌去離子水補(bǔ)齊至 50 μL；反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸 30 s，循環(huán)40次，最后72℃延伸5 min，4℃保存。

1.2.4 測(cè)序單鏈的制備

將3 μL鏈親和素包被的磁珠和47 μL的binding buffer混勻，然后加入到 50 μL的 PCR產(chǎn)物中，1 300 r/min～1 400 r/min，室溫振蕩混勻 10 min～15 min；在PSQ Low反應(yīng)板中預(yù)先加入40 μL含有0.3 μmol/L測(cè)序引物的Annealing Buffer；在Vacuum prep workstation中，進(jìn)行單鏈制備，備用。

1.2.5 測(cè)序反應(yīng)體系

測(cè)序反應(yīng)的總體積約為150 μL，其中各種成分分別為：PCR產(chǎn)物 50 μL，Sepharose Beads 3 μL，Binding Buffer 47 μL （10 mmol/L Tris－HCl，2 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，0.1%Tween20，pH7.6），10 μmol/L 測(cè)序引物 1.2 μL，Annealing Buffer 38.8 μL （20 mmol/L Tris－AC，2 mmol/L MgAC2，pH7.6），再根據(jù)軟件提示在試劑艙相對(duì)應(yīng)位置加入所需的底物，酶和A、C、G、T。

1.2.6 測(cè)序反應(yīng)程序

采用SQA模式，按照CGCGACGCTAGCGTCT的堿基排列順序進(jìn)行測(cè)序。

1.2.7 添加靈敏度對(duì)比試驗(yàn)

將四種致病菌菌液分別進(jìn)行10倍梯度稀釋，篩選出 105、104、103、102、10、1、0 CFU/mL 的菌懸液，各取1 mL添加于24 mL無(wú)菌牛奶樣本中，備用。將上述一系列25 mL牛奶樣本按照傳統(tǒng)國(guó)標(biāo)方法增菌，并進(jìn)行后期生化鑒定[7－10]；同時(shí)將增菌后的典型菌落，用煮菌法提取模板DNA，用于PCR擴(kuò)增而后進(jìn)行焦磷酸測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 引物設(shè)計(jì)結(jié)果

通過(guò)NCBI、KEGG等數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索，獲得沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌的相關(guān)序列，并通過(guò)ClustalW程序進(jìn)行同源性分析，應(yīng)用焦磷酸測(cè)序儀配套專業(yè)軟件分別對(duì)四種菌的16SrR NA保守序列進(jìn)行同源性分析，通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)四種菌的16SrR NA序列同源性適度，且又存在差異，適合設(shè)計(jì)焦磷酸測(cè)序通用擴(kuò)增引物和測(cè)序引物，引物設(shè)計(jì)情況見(jiàn)表1。

表1 通用擴(kuò)增引物和測(cè)序引物序列Table 1 PCR amplification primers and sequencing primers

2.2 PCR反應(yīng)擴(kuò)增結(jié)果

擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為50 μL，其各種成分分別為：2×GoTaqRMaster Mix 25 μL，10 μmol/L 引物各 1 μL，模板 DNA 2 μL，用滅菌去離子水補(bǔ)齊至 50 μL；反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)40次，最后72℃延伸5 min，4℃保存。取PCR產(chǎn)物5 μL用2%的瓊脂糖凝膠電泳，均能擴(kuò)增出目的片段大小的單一條帶，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 四種食源性致病菌通用引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析圖譜Fig.1 Result of PCR amplification of Four Kinds of Food-borne Pathogenic Bacteria

2.3 焦磷酸測(cè)序結(jié)果

根據(jù)對(duì)四種食源性致病菌16SrRNA序列分析，設(shè)計(jì)通用擴(kuò)增引物和測(cè)序引物，四種食源性致病菌均可用一組16SrRNA擴(kuò)增引物得到高濃度的PCR產(chǎn)物，再通過(guò)同一條測(cè)序引物分析四種食源性致病菌的差異位點(diǎn)，已知位點(diǎn)差異分別為：沙門氏菌CGC ACG CAG GCG GTCT；金黃色葡萄球菌CGCGCGTAGGCGGTTT；志賀氏菌CGCACGCAGGCGGTTT；單增李斯特菌CGCGCG CAGGCGGTCT，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)方法焦磷酸測(cè)序后結(jié)果與已知位點(diǎn)差異完全吻合，焦磷酸測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖2～圖5，4種食源性致病菌位點(diǎn)差異模擬圖見(jiàn)圖6～圖9。

圖2 沙門氏菌擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果圖Fig.2 Result of Pyrosequencing of Salmonellla spp

圖3 金黃色葡萄球菌擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果圖Fig.3 Result of Pyrosequencing of Staphylococcus aureus

圖4 志賀氏菌擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果圖Fig.4 Result of Pyrosequencing of Shigella spp

圖5 單核細(xì)胞增生李斯特菌擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果圖Fig.5 Result of Pyrosequencing of Listeria monocytogenes

圖6 沙門氏菌位點(diǎn)差異模擬圖Fig.6 Simulation chart of site difference of Salmonellla spp

圖7 金黃色葡萄球菌位點(diǎn)差異模擬圖Fig.7 Simulation chart of site difference of Staphylococcus aureus

圖8 志賀氏菌位點(diǎn)差異模擬圖Fig.8 Simulation chart of site difference of Shigella spp

圖9 單核細(xì)胞增生李斯特菌位點(diǎn)差異模擬圖Fig.9 Simulation chart of site difference of Listeria monocytogenes

2.4 添加靈敏度對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果

四種食源性致病菌的傳統(tǒng)國(guó)標(biāo)方法鑒定結(jié)果為105、104、103、102、10 CFU/mL 的添加樣品均檢出，1 CFU/mL和0 CFU/mL的添加樣品未檢出；焦磷酸測(cè)序方法測(cè)序結(jié)果為 105、104、103、102、10 CFU/mL 的添加樣品均檢出，1 CFU/mL和0 CFU/mL的添加樣品未檢出。由此可見(jiàn)，焦磷酸測(cè)序方法與傳統(tǒng)國(guó)標(biāo)的生化鑒定方法完全可達(dá)到相同的靈敏度，但省去了后期繁瑣而費(fèi)時(shí)的生化鑒定步驟，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 焦磷酸測(cè)序及國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)靈敏度比較結(jié)果Table 2 Comparative sensitivities of Pyrosequencing and National standard method

3 結(jié)論

傳統(tǒng)國(guó)標(biāo)法的生化培養(yǎng)一直是食源性致病菌檢測(cè)方法的金標(biāo)準(zhǔn)，但隨著食品安全問(wèn)題各種應(yīng)急預(yù)案的不斷發(fā)生，生化培養(yǎng)的較長(zhǎng)時(shí)間已逐漸造成應(yīng)急預(yù)案在最短的時(shí)間內(nèi)判讀和控制的困擾，因此各種快速檢測(cè)技術(shù)不斷涌現(xiàn)，免疫學(xué)法、測(cè)試片法、PCR方法、LAMP技術(shù)等等，而這些快檢技術(shù)都存在著自身相應(yīng)的不足，比如，免疫學(xué)方法假陰性高，人為要求操作水平影響較大；測(cè)試片儲(chǔ)存時(shí)間極短，一旦開封剩余測(cè)試片儲(chǔ)存時(shí)間最多兩個(gè)月，且不易保存；PCR方法存在氣溶膠污染；LAMP方法，易出現(xiàn)假陰性、假陽(yáng)性的結(jié)果，且結(jié)果不易穩(wěn)定，那么無(wú)疑測(cè)序技術(shù)是目前相關(guān)技術(shù)中最本質(zhì)的從基因序列水平判讀結(jié)果的方法，可靠性大大增強(qiáng)。

焦磷酸測(cè)序技術(shù)較傳統(tǒng)的Sanger金標(biāo)法具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，焦磷酸測(cè)序技術(shù)可以應(yīng)用于短片端序列的判讀，可直接判讀測(cè)定引物后面的模板序列，無(wú)需電泳，也無(wú)需熒光染色，操作簡(jiǎn)便，成本相對(duì)較低，且一次可完成96個(gè)樣本的檢測(cè)，通量高；檢測(cè)實(shí)時(shí)快速，20 bp左右的序列，僅需10多分鐘即可完成。

不同細(xì)菌的16SrRNA由于其基因既具有高度保守序列，又具有各自特有的多變序列，因此被公認(rèn)為細(xì)菌種屬水平檢測(cè)的專屬基因。利用這一特性，近年來(lái)也建立了一些能同時(shí)檢測(cè)多種細(xì)菌的PCR方法，如PCR-限制性內(nèi)切酶片段分析[11]，PCR-反向斑點(diǎn)雜交[12-13]等，但這些方法操作復(fù)雜，分析繁瑣，不適用于應(yīng)急預(yù)案快速準(zhǔn)確的判讀。

本研究通過(guò)構(gòu)建一組通用引物，同時(shí)得到四種食源性致病菌的高濃度PCR單一產(chǎn)物，利用測(cè)序引物，通過(guò)四種菌可變區(qū)2個(gè)～3個(gè)堿基位點(diǎn)差異，判讀細(xì)菌不同種屬。測(cè)序結(jié)果與傳統(tǒng)國(guó)標(biāo)法比較，得到了100%的吻合率，且具備較高的靈敏度。由此證明本研究所建立的焦磷酸測(cè)序方法適合于食源性致病菌的快速檢測(cè)，且將微生物檢測(cè)基于分子水平的研究，實(shí)現(xiàn)了在基因水平上對(duì)致病微生物進(jìn)行最本質(zhì)的序列分析及鑒定[14-15]。

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