TNF-α誘導(dǎo)的衰老血管內(nèi)皮細(xì)胞中泛素、細(xì)胞周期的變化及意義

趙海梅，譚 翌，楊小端

(南昌大學(xué)第三附屬醫(yī)院，南昌 330008)

血管內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)被覆全身血管內(nèi)膜，其不僅僅是血液和組織的屏障，還具有其他多種功能，如減少血管通透性、抗血栓作用、調(diào)節(jié)血管平滑肌、抑制血管壁細(xì)胞的游走和增殖等多種功能。內(nèi)皮細(xì)胞受到破壞、損傷，功能降低，引起許多心腦血管疾病發(fā)生、發(fā)展。腫瘤壞死因子α(TNF-α)是由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生、釋放的，具有強(qiáng)大功能的炎癥細(xì)胞因子，它可調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能、改變其基因表達(dá)譜［1］。TNF-α引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷破壞在很多心腦血管疾病和血栓疾病的發(fā)病中具有重要意義。泛素—蛋白酶體是由泛素以及一系列相關(guān)的酶組成。對細(xì)胞內(nèi)多種基本活動非常重要，如降解非必需蛋白質(zhì)、控制體內(nèi)蛋白質(zhì)的降解過程。而當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)裂解作用發(fā)生異常時(shí)，正常降解過程受到破壞從而產(chǎn)生疾病。2011年3月～2012年3月，我們觀察了衰老血管內(nèi)皮細(xì)胞泛素的表達(dá)及細(xì)胞周期的改變，并探討了其與心血管疾病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 原代血管內(nèi)皮細(xì)胞分離取自剖腹產(chǎn)嬰兒術(shù)后的新鮮臍帶。M199完全培養(yǎng)基(含20%胎牛血清、4 ng/mL VEGF，Gibco 公司，USA)，胰蛋白酶(Gibco公司，USA)。Trizol試劑(Gibco公司，USA)，PCR引物由北京奧科生物公司合成。流式細(xì)胞儀采用美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)與分組 取新鮮臍帶約15 cm，剪除兩側(cè)受損部分，PBS沖洗靜脈淤血。向臍靜脈內(nèi)注入0.25%胰蛋白酶約10 mL。放入37℃ PBS液中消化10 min。吸出臍靜脈內(nèi)消化液，注入離心管中，同時(shí)加入新生胎牛血清終止消化。1000 r/min離心5 min，吸除上清液，加入M199完全培養(yǎng)基。取0.1 mL細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至5×105/mL，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中。置于5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)。24 h換液，除去死亡細(xì)胞及紅細(xì)胞。以后每隔2 d換液1次，并補(bǔ)充營養(yǎng)液。當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中融合80%以上時(shí)，0.25%胰蛋白酶3 mL加入內(nèi)皮細(xì)胞中消化分離。倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞皺縮、分離時(shí)加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化。吸管吹打，制成2×105/mL的細(xì)胞懸液，按上述培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)傳代。一般約4 d行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。選取培養(yǎng)瓶中細(xì)胞形態(tài)良好的第2代臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞分為空白對照組、實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組加入20 ng/mL TNF-α 24 h刺激細(xì)胞加速衰老，空白對照組不予處理。

1.2.2 泛素的檢測 血管內(nèi)皮細(xì)胞融合80%以上，收集空白對照組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，溶解于20 μL DEPC處理過的三蒸水，備用。在基因庫中查得人泛素 DNA序列，應(yīng)用primer5.0設(shè)計(jì)引物。泛素上游引物為5'-TTCGTGAAGACCCTGACCG-3'，下游引物為5'-GGATCTTGGCCTTCACGTTCT-3'。內(nèi)參照GAPDH上游引物為5'-CTCCATCATGAAGTGTGA CGTT-3'，下游引物為5'-ATCTCCTTCTGCATCCTGTCAG-3'，PCR 引物由北京奧科生物公司合成。首次循環(huán)94℃變性5 min，94℃變性30 s，52℃ 退火45 s，72℃延伸60 s，共34個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，2%瓊脂糖凝膠中行凝膠電泳分析。

1.2.3 細(xì)胞周期檢測 選取第2代細(xì)胞，待細(xì)胞融合80%以上，實(shí)驗(yàn)組加入20 ng/mL TNF-α繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用0.25% 胰蛋白酶消化分離細(xì)胞，1000 r/min離心5 min棄上清液，PBS沖洗2次，重懸于500 μL的PBS中，加入5 mL冷乙醇，4℃ 固定過夜。1000 r/min離心5 min，棄乙醇，用5 mL的 PBS+1%胎牛血清洗2次，加入100 μL的10×PI溶液(用 PBS 配制成 500 μL/mL PI，pH 7.0);加入 100 μL RnaseA(用雙蒸水配制成 10 mg/mL，pH 7.5，煮沸15 min)，37℃ 孵育30 min;流式細(xì)胞術(shù)分析(激發(fā)光波長488 nm，發(fā)射光波長570 nm);每次獲取15000個(gè)細(xì)胞，采用BD公司的sinmulSET軟件進(jìn)行測定及分析。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，比較采用配對t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組泛素mRNA檢測結(jié)果比較 泛素 mRNA的表達(dá)在空白對照組明顯低于實(shí)驗(yàn)組(P＜0.05)。見圖 1、2。

圖1 兩組泛素、β-actin RT-PCR凝膠電泳結(jié)果

圖2 兩組泛素mRNA表達(dá)水平比較

2.2 兩組細(xì)胞周期的變化 空白對照組細(xì)胞生長旺盛，細(xì)胞增殖旺盛，處于S期的細(xì)胞明顯多于實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長減慢，細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期的的比例逐漸降低，從G2期進(jìn)入M期的比例逐漸增加，細(xì)胞增殖指數(shù)降低。詳見圖3、表1。

3 討論

圖3 對照組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞周期

表1 對照組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞周期比較(%)

血管內(nèi)皮系統(tǒng)除了作為血液和組織間代謝交換的屏障外，還可產(chǎn)生和分泌多種生物活性物質(zhì)，對調(diào)節(jié)血壓和體液平衡具有重要意義［2］。其結(jié)構(gòu)完整和功能正常是多種心血管疾病發(fā)生的重要影響因素。衰老及炎癥因子等導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞完整性的破壞和內(nèi)皮細(xì)胞功能不全，可引發(fā)各種疾病。動脈粥樣硬化時(shí)TNF-α合成增多;而人類典型動脈粥樣硬化斑塊中TNF-α陽性率高達(dá)90%，且與粥樣硬化的嚴(yán)重程度成正比。因此，血管內(nèi)皮功能障礙被認(rèn)為是早期動脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制中的重要事件，同動脈粥樣硬化、冠狀動脈疾病、心血管事件的危險(xiǎn)因素有密切的關(guān)系［3］。

泛素—蛋白酶體是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解主要途徑之一，不但可以清除損傷蛋白，而且還參與細(xì)胞凋亡、炎癥、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期等生物過程［4］。泛素—蛋白酶體途徑是細(xì)胞內(nèi)ATP依賴的蛋白質(zhì)選擇性降解的主要途徑，是真核細(xì)胞內(nèi)重要的蛋白質(zhì)質(zhì)控系統(tǒng)，參與細(xì)胞凋亡、MHCⅠ類抗原的遞呈、細(xì)胞周期以及細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生理過程，對維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)具有十分重要的意義［5］。與泛素相關(guān)的疾病可分為2種:一種是泛素體系酶突變導(dǎo)致的功能喪失或者是目標(biāo)底物蛋白識別基序的改變，導(dǎo)致某種蛋白的不穩(wěn)定;另一種是目標(biāo)蛋白功能不正?；蚣铀俳到?。泛素—蛋白酶體途徑是細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素，細(xì)胞的許多重要蛋白都在此通路的調(diào)控之下。

泛素—蛋白酶體通路對細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞生長調(diào)控是一個(gè)很重要的調(diào)節(jié)因素，并與許多生理及病理過程密切相關(guān)。核因子-κB(NF-κB)被認(rèn)為是在動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展過程中介導(dǎo)炎癥—增殖反應(yīng)的一種重要的調(diào)節(jié)因子。在NF-κB的激活中，泛素—蛋白酶體起到重要作用。正常情況下，內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的一氧化氮(NO)能夠抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，從而拮抗動脈粥樣硬化的啟動，但是各種損傷性刺激增加了氧化應(yīng)激，使NO的生物利用度減少。抑制泛素—蛋白酶體能夠上調(diào)一氧化氮合酶的表達(dá)，促進(jìn)NO的合成［6］。在復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)系統(tǒng)中，泛素—蛋白酶體系統(tǒng)在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期各個(gè)階段及各階段之間的轉(zhuǎn)換中具有重要作用［7］。不穩(wěn)定的動脈粥樣硬化斑塊中，氧化低密度脂蛋白的增加或半衰期延長的蛋白質(zhì)聚集，可導(dǎo)致泛蛋白—蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)功能損傷。因?yàn)槎虊勖拇俚蛲龅鞍譸53、bax、p27在細(xì)胞內(nèi)是通過UPS降解的，因此，泛素化通路缺陷時(shí)，細(xì)胞內(nèi)上述蛋白質(zhì)含量增多，可使細(xì)胞周期停滯并凋亡。而細(xì)胞周期狀態(tài)反映了細(xì)胞的增殖能力。凋亡細(xì)胞增加，血管功能進(jìn)一步受到損傷，結(jié)構(gòu)遭到破壞。血管內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)亡可以引起一系列血管結(jié)構(gòu)和功能的改變，最終導(dǎo)致動脈硬化的發(fā)生。

本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組衰老血管內(nèi)皮細(xì)胞泛素表達(dá)增高，同時(shí)細(xì)胞周期停滯，細(xì)胞凋亡增加，內(nèi)皮功能受損。說明泛素—蛋白酶體除了移除受損蛋白質(zhì)作用外，還參與其他一系列生理病理過程，包括再生、凋亡等，而這些都是動脈粥樣硬化的重要特征［8］。已有研究表明，在動物擴(kuò)張性心肌病及缺血性心肌病中，泛素化蛋白質(zhì)的表達(dá)明顯升高［9］。而心臟蛋白酶體是一個(gè)復(fù)雜的、異構(gòu)的、動態(tài)的細(xì)胞器。心臟在壓力超負(fù)荷、缺血或衰老等時(shí)功能退化，均可引起心肌細(xì)胞內(nèi)泛素—蛋白酶體發(fā)生變化，導(dǎo)致疾病的發(fā)生、發(fā)展［10］。因此，我們應(yīng)進(jìn)一步研究泛素—蛋白酶系統(tǒng)，改善其功能，減少疾病的發(fā)生、發(fā)展。

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