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    胃癌變過程中Bcl-2 mRNA與幽門螺桿菌感染及細胞凋亡的關系

    2013-09-04 13:12:42劉愛群葛蓮英韋宗萍耿芳芳林思彤
    山東醫(yī)藥 2013年9期
    關鍵詞:螺桿菌幽門染色

    劉愛群,葛蓮英,韋宗萍,耿芳芳,羅 元,林思彤

    (1 廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院,南寧 530021;2 廣西醫(yī)科大學第一附屬臨床醫(yī)學院)

    胃癌(GC)是人類第四大惡性腫瘤,約60% ~80%的GC患者癌組織中可以檢測到幽門螺桿菌(Hp)。流行病學調查顯示,Hp感染人群發(fā)生GC的風險是非感染人群的6倍[1,2]。持續(xù)的Hp感染可導致慢性淺表性胃炎(CSG)→慢性萎縮性胃炎(CAG)→腸化生(IM)→不典型增生(AH)→GC的病理過程[3,4]。B 細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)基因是細胞凋亡抑制基因,其與胃癌變過程中的Hp感染密切相關[5]。2008年8月~2010年2月,我們采用熒光定量技術分析胃癌變過程中Bcl-2 mRNA表達水平的改變,并結合細胞凋亡及Hp感染情況,探討B(tài)cl-2 mRNA對Hp感染所致胃癌變過程的影響及機制。

    1 資料與方法

    1.1 臨床資料 收集2008年8月~2010年2月廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院和附屬腫瘤醫(yī)院胃鏡活檢的胃竇部組織和外科手術切除的胃黏膜組織280例,其中男170例、女110例,年齡21~79(50.8 ±11.2)歲。組織學診斷根據(jù)2000年全國慢性胃炎研討會制定的病理診斷標準[6]。其中CSG 62例(CSG組)、CAG 55例(CAG 組)、IM 52例(IM 組)、AH 46例(AH組)、GC 65例(GC組)。GC患者在手術前均未接受放化療或免疫治療。每例標本分為兩份,一份經(jīng)10%的甲醛溶液固定,常規(guī)石蠟包埋,制備4 μm厚連續(xù)切片,分別行HE、Hp特殊染色和原位末端標記法(TUNEL)染色;另一份用液氮保存,置于-80℃冰箱備RNA提取。

    1.2 胃組織相關指標檢測

    1.2.1 Bcl-2 mRNA表達 采用實時熒光定量(Real-time)PCR。Trizol試劑提取組織中總RNA,計算RNA含量及純度鑒定,瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性,逆轉錄為cDNA,利用特異性引物擴增目的基因。Bcl-2上游引物:5'-CATGTGTGTGGAGAGCGTCAA-3',下游引物:5'-GCCGGTTCAGGTACTCAGTCA-3',擴增片段長度為 83 bp;內參GAPDH上游引物:5'-CCACTCCTCCACCTTTGAC-3',下游引物:5'-ACCCTGTTGCTGTAGCCA-3',擴增長度為102 bp。所有引物均由上海生工生物技術有限公司合成。采用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物,回收產(chǎn)物與載體pGEM?-T連接,經(jīng)電泳和測序鑒定證實為重組pGEM?-T-survivin(GAPDH)質粒,用質粒初始拷貝數(shù)與實時熒光定量所檢測的CT值建立雙標準曲線,用于檢測Bcl-2 mRNA的表達。

    1.2.2 凋亡細胞 采用TUNEL染色,按常規(guī)方法進行脫蠟及水化,高溫修復,封閉,進入標記反應,依次滴加TdT酶反應液、Streptavidin工作液,DAB顯色,蘇木精復染,漂洗,晾干,封片,觀察。以細胞核呈棕褐色染色為陽性凋亡細胞,部分細胞質也可因核DNA碎片的逸出呈陽性染色。在OLYMPUS BX-40多功能顯微鏡下選取凋亡細胞最多的5個高倍視野,計數(shù)每個視野100個細胞中的凋亡細胞數(shù),用百分數(shù)表示,取平均值計算凋亡指數(shù)(AI)。TUNEL染色陽性信號呈棕黃色,位于細胞核內,濃縮的核質緊貼于核膜,或核質呈現(xiàn)均勻的染色。

    1.2.3 Hp檢測 采用快速尿素酶法、甲苯胺藍染色和Warthin-Starry銀染法檢測組織中Hp。尿素酶染色陽性為組織塊邊緣呈櫻紅色;甲苯胺藍染色陽性為組織呈藍色;Warthin-Starry法染色陽性為組織呈棕黑色。以三種方法中兩種或兩種以上染色者為Hp陽性,否則為Hp陰性。

    1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件,計量資料用表示,采用成組t(t')檢驗、計數(shù)資料采用χ2檢驗,相關性分析采用Spearman等級相關分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 Bcl-2 mRNA表達 Bcl-2 mRNA在GC中呈強表達,見圖1。CSG組、CAG組、IM組、AH組、GC組Bcl-2 mRNA陽性表達率分別為22.6%(14/62)、30.9%(17/55)、40.4%(21/52)、58.7%(27/46)、69.2%(45/65),Bcl-2 mRNA 表達水平分別為0.095±0.015、0.115 ± 0.012、0.173 ± 0.027、0.224 ±0.042、0.368 ± 0.036。IM 組、AH 組、GC 組 Bcl-2 mRNA表達水平高于 CSG組、CAG組(P均 <0.01),AH 組高于 IM 組(P <0.01),GC 組高于 IM、AH 組(P 均 <0.01)。

    圖1 GC組Bcl-2 mRNA擴增電泳圖(Real-time PCR)

    2.2 Bcl-2 mRNA表達及其與細胞凋亡的關系 從CSG→CAG→IM→AH→GC,Bcl-2 mRNA的表達量與 AI呈負相關(rs=-0.700,P <0.05)。

    2.3 GC形成過程中Bcl-2 mRNA表達與Hp感染的關系 全部280例標本 Hp感染率為53.6%(150/280),Hp主要存在于胃黏膜表面的黏液、細胞表面、胃小凹、腺腔及癌旁黏膜中,呈彎曲狀、海鷗狀及桿狀,多聚集成群。GC組織中少見 Hp。在IM、AH、GC組Hp陽性者的組織中Bcl-2 mRNA表達均明顯高于Hp陰性者(P<0.05或0.01)。見表1。

    表1 各組Bcl-2 mRNA表達及與Hp感染關系()

    表1 各組Bcl-2 mRNA表達及與Hp感染關系()

    注:與同組 Hp(-)比較,*P <0.05,△P <0.01

    組別 n Bcl-2 mRNA(CT值)CSG 組Hp(+) 5 0.097 ±0.010 Hp(-) 9 0.094 ±0.018 CAG組Hp(+) 10 0.117 ±0.010 Hp(-) 7 0.113 ±0.014 IM組Hp(+) 13 0.183 ±0.028*Hp(-) 8 0.157 ±0.017 AH組Hp(+) 21 0.237 ±0.034△Hp(-) 6 0.177 ±0.033 GC組Hp(+) 36 0.377 ±0.030△Hp(-)0.333 ±0.0369

    3 討論

    近年研究提出了許多Hp致GC的可能機制:一是細菌的代謝產(chǎn)物直接轉化黏膜;二是Hp DNA的片段轉移入宿主細胞,引起轉化;三是Hp引起炎癥反應,造成長期慢性炎癥刺激,其本身具有基因毒性作用[7,8]。其中第三種機制得到了最廣泛的認可。GC是一個涉及多階段、多基因改變的多步驟過程。對胃黏膜癌變過程中基因表達變化的進一步研究,將有助于了解宿主細胞的抵抗策略和適應性變化的根本機制,從而為干預相關環(huán)節(jié)、減輕宿主細胞對Hp的易感性提供新的思路[9]。

    研究表明,細胞凋亡調節(jié)機制的失控與腫瘤發(fā)生密切相關[10~12],Bcl-2可能是其中的一個關鍵性因子。Bcl-2主要功能是發(fā)現(xiàn)、登記和評價細胞內的損傷,整合相互矛盾和競爭信號,發(fā)出細胞命運的指令,作為抗凋亡基因,它不是通過加速細胞的有絲分裂,而是延長其生存期[13]。劉鎖貴等[14]發(fā)現(xiàn) Hp感染可明顯促進胃黏膜細胞表達Bcl-2蛋白,進而阻止細胞凋亡的級聯(lián)反應,使細胞凋亡減少,隨著時間的延長,這種促進作用也逐漸加強。因此,Hp感染所引起的長期慢性炎癥過程中,Bcl-2的過表達可能使異形細胞凋亡減少、促進胃癌變的發(fā)生。

    本研究采用較為敏感的實時熒光相對定量來檢測胃癌變過程中Bcl-2基因表達水平的改變,發(fā)現(xiàn)隨著惡變程度的進展,Bcl-2 mRNA表達陽性率和表達量逐漸上升,AI也隨之逐漸減少,在胃癌變早期(IM→AH→GC)由Bcl-2介導和調控的抑制異形細胞凋亡作用逐漸增強,提示GC的發(fā)生是一個由量變到質變的多階段漸進過程。而Bcl-2 mRNA的表達在IM、AH、GC組Hp陽性者均高于Hp陰性,提示從癌前病變階段起,Hp感染后Bcl-2表達上調,異形細胞的凋亡明顯減少,促進了胃癌變的演進過程,而Hp在該過程中發(fā)揮了啟動子的作用。最近我們相關的研究也表明:Hp感染后同樣能引起凋亡相關基因表達水平的改變[15]。

    綜上所述,在Hp感染所致的胃癌變過程中,Bcl-2可能作為一個癌基因,通過抑制惡性轉化的異形細胞的凋亡,參與GC的發(fā)生和發(fā)展進程。同時,在Hp感染胃癌變過程中,Bcl-2與各種凋亡調控基因之間可能存在某種交互作用,但具體通路尚待更為深入的研究。

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