微波法提取玉米須抗痛風(fēng)活性組分的工藝研究

郭兵兵，張 燕，趙文竹，于志鵬，安曉寧，劉靜波，*

(1.吉林大學(xué)軍需科技學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130062;2.吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130022)

痛風(fēng)(Gout)是長(zhǎng)期嘌呤代謝障礙、血尿酸增高引起組織損傷的一組異質(zhì)性疾病［1］。臨床通常表現(xiàn)為急性關(guān)節(jié)炎反復(fù)發(fā)作、痛風(fēng)石沉積、關(guān)節(jié)活動(dòng)障礙和畸形;而且還容易累及腎臟和心血管系統(tǒng)，造成腎尿酸結(jié)石和痛風(fēng)性腎實(shí)質(zhì)性病變等［2］。目前，用于調(diào)節(jié)尿酸代謝和治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的藥物有別嘌呤醇、丙磺舒、苯溴馬隆、秋水仙堿和糖皮質(zhì)激素等。然而這些藥物有許多副作用，如引起頭痛、皮疹、水腫、胃腸出血、慢性腎乳頭壞死及致死性超敏綜合癥等，從而在很大程度上限制了其在臨床上的應(yīng)用［3－5］。玉米須，俗稱棒子毛，禾本科植物玉蜀黍的花柱和柱頭。含有多種營(yíng)養(yǎng)成分:黃酮、多糖、氨基酸、生物堿、β－谷甾醇、維生素、無(wú)機(jī)鹽等。研究表明玉米須黃酮類化合物可以抑制黃嘌呤氧化酶(XOD)活性，從而降低體內(nèi)尿酸水平，達(dá)到治療痛風(fēng)的目的［6］。日本學(xué)者Nguyen通過(guò)對(duì)288種越南藥用植物提取物的XOD抑制率進(jìn)行測(cè)定，證實(shí)有效成分中含有黃酮類化合物［7］。國(guó)內(nèi)學(xué)者也證實(shí)玉米須提取物具有抗痛風(fēng)活性［8－9］。本文采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)優(yōu)化玉米須黃酮的微波萃取工藝，并綜合考慮黃酮提取率以及酶抑制率兩個(gè)指標(biāo)，確定了玉米須抗痛風(fēng)活性組分的最佳提取條件，為以后研究開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米須 吉林大學(xué)營(yíng)養(yǎng)與功能食品研究室提供;蘆丁、別嘌呤醇、黃嘌呤氧化酶、黃嘌呤 美國(guó)Sigma公司;氫氧化鈉、無(wú)水氯化鋁、硝酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、無(wú)水乙醇 均為分析純，北京化工廠。

MILIPORE牌超純水機(jī) 美國(guó);UV2550島津紫外可見光分光光度計(jì) 島津國(guó)際貿(mào)易有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、恒溫水浴鍋、循環(huán)水真空泵 鞏義市英峪高科儀器廠;FW－200萬(wàn)能粉碎機(jī) 北京中興偉業(yè)儀器有限公司;MAS－Ⅱ微波萃取儀 上海新代微波化學(xué)科技有限公司;電熱恒溫培養(yǎng)箱 湖北省黃石市醫(yī)療器械廠;標(biāo)準(zhǔn)篩 紹興海特儀器有限公司;METTLER TOLEDO XS205電子稱 瑞士。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 玉米須抗痛風(fēng)活性物質(zhì)的提取工藝流程 干燥的玉米須→粉碎→過(guò)40目篩→微波萃取→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮→干燥→加醇溶解→定容→活性測(cè)定

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 微波功率單因素實(shí)驗(yàn) 取粉碎后的玉米須5.00g，用60%的乙醇按照液料比20∶1(mL/g)浸泡，60℃下，分別在微波功率為 400、500、600、700、900W條件下萃取20min。料液分離后，45℃下熱風(fēng)干燥。然后用30%的乙醇溶解，制備4mg·mL－1的待測(cè)液，按照1.2.5的方法測(cè)定黃酮提取率。再用去離子水將其稀釋成3%乙醇溶解的濃度為200μg·mL－1的待測(cè)樣液，按照1.2.4給出的方法測(cè)定其酶抑制率。黃酮提取率和酶抑制率按3∶7的權(quán)重計(jì)算提取總效果值。

1.2.2.2 微波時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn) 取粉碎后的玉米須5.00g，用60%乙醇按照液料比20∶1(mL/g)浸泡，在微波溫度60℃，微波功率600W條件下，分別萃取5、10、15、20、25min。以下操作同 1.2.2.1。

1.2.2.3 乙醇濃度單因素實(shí)驗(yàn) 取粉碎后的玉米須5.00g，分別用40%、50%、60%、70%、80%的乙醇按照液料比20∶1(mL/g)浸泡，然后控制微波溫度60℃，微波功率為600W 萃取20min。以下操作同1.2.2.1。

1.2.2.4 液料比單因素實(shí)驗(yàn) 取粉碎后的玉米須5.00g，用 60%乙醇分別按照 10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1(mL/g)液料比浸泡，然后在60℃，微波功率為600W條件下萃取20min。以下操作同1.2.2.1。

1.2.3 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)方法 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇合適的參數(shù)范圍，對(duì)微波功率、微波時(shí)間、乙醇濃度以及液料比四個(gè)因素進(jìn)行了二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)自變量因素編碼及水平見表1。

表1 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼表Table 1 Factors and levels coding of the orthogonal rotation test

1.2.4 抗通風(fēng)活性測(cè)定

1.2.4.1 尿酸的最大吸收波長(zhǎng)的檢測(cè) 向黃嘌呤溶液中加入適量XOD，反應(yīng)一段時(shí)間后在200～800nm下進(jìn)行慢速掃描獲得圖譜。

圖1 尿酸在200～400nm的掃描結(jié)果Fig.1 Result of scanning solution of uric acid at wavelength of 200～400nm

1.2.4.2 黃嘌呤－黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生尿酸的檢測(cè) 向試管中加入 300μL 的提取液(200μL/mL)，210μL pH7.5的 PBS緩沖溶液，然后加入 180μL的0.01U/mL剛配制的黃嘌呤氧化酶［10］溶液，25℃下靜置15min后，加入360μL 1.5mol/L的黃嘌呤溶液?；旌暇鶆?，25℃下反應(yīng) 30min，加入 150mL 1mol/L HCl終止反應(yīng)，290nm測(cè)定吸光度。先加入150μL的鹽酸再加入XOD為空白對(duì)照。測(cè)定值與空白值之差為尿酸的吸光度。別嘌呤醇為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.4.3 XOD活性的計(jì)算 XOD活性的計(jì)算采用抑制百分率來(lái)表示:

式中，A:用3%的乙醇溶液代替提取物樣液，在290 nm條件下測(cè)定的吸收值;B:反應(yīng)前后吸光度的差值。

所有測(cè)定值均為三次測(cè)定值的平均值。

總效果值(%)=(黃酮提取率×30%+酶抑制率×70%)×100

1.2.5 黃酮提取率測(cè)定［11］采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法。稱取干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10mg，用30%的乙醇溶解，定容至25mL，搖勻得0.4mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、12.0mL 的 0.4mg/mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液置于25mL的容量瓶中，加入3%的乙醇10.0mL，再加入0.7mL的5%的亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置5min;加入0.7mL的10%AlCl3(w/w)溶液，搖勻，靜置6min，加入5mL的10%氫氧化鈉，30%的乙醇定容至刻度。放置10min后，以試劑空白作參比，于500nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。繪制濃度－吸光度曲線，對(duì)數(shù)據(jù)求算回歸方程，得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)工作曲線:y=7.447x+0.0433，R2=0.9999。黃酮提取率(%)=黃酮濃度/提取液濃度×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素分析

2.1.1 微波功率對(duì)玉米須總黃酮提取率以及酶抑制率的影響 從圖2可知，當(dāng)微波功率達(dá)到600W時(shí)，其總的提取效果最好。隨著微波功率的繼續(xù)增加，其總的提取效果不再發(fā)生顯著變化。這可能是由于微波功率的繼續(xù)增加，破壞了其有效成分，從而導(dǎo)致其總提取效果下降。綜合考慮后，選取最適微波功率為600W。

圖2 微波功率對(duì)玉米須黃酮提取率、酶抑制率的影響及提取總效果值Fig.2 Effect of microwave power on the yield of flavonoids，the enzyme inhibition ratio and the extraction total effect value

2.1.2 微波時(shí)間對(duì)玉米須總黃酮提取率以及酶抑制率的影響 從圖3可知，當(dāng)萃取時(shí)間在15min以下時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，其總的提取效果沒(méi)有多大變化。而當(dāng)微波時(shí)間達(dá)到20min時(shí)，其總的提取效果達(dá)到最好。當(dāng)時(shí)間再增長(zhǎng)時(shí)，其總的提取效果反而減小。這一趨勢(shì)與黃酮提取率、酶抑制率的單獨(dú)效果趨勢(shì)相同。這可能是由于在20min以下時(shí)，其提取效果不徹底;當(dāng)提取時(shí)間大于20min時(shí)，其提取物又因?yàn)槲⒉〞r(shí)間過(guò)長(zhǎng)而被降解或破壞，導(dǎo)致其總的提取效果降低。綜合考慮后選取最適微波時(shí)間為20min。

圖3 微波時(shí)間對(duì)玉米須黃酮提取率、酶抑制率的影響及提取總效果值Fig.3 Effect of microwave time on the yield of flavonoids，the enzyme inhibition ratio and the extracting total effect value

2.1.3 乙醇濃度對(duì)玉米須總黃酮提取率以及酶抑制率的影響 從圖4可知，提取物的總效果一開始隨著乙醇濃度的增加而增大，當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，達(dá)到最大值。然后隨著乙醇濃度的增加，其提取物的總效果降低。這一規(guī)律與黃酮提取率測(cè)定結(jié)果相符。當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，黃酮提取率最高;乙醇濃度增大或者減小，總黃酮的得率都減少。而酶抑制率最高時(shí)，乙醇濃度為50%。其主要原因是乙醇濃度不同，其提取劑的極性不同，所提取得到的黃酮類化合物種類不同，不同種類黃酮其酶抑制活性不同，從而造成50%乙醇濃度下的提取物的酶抑制率要高于60%條件下的酶抑制率。綜合考慮后選取最適乙醇濃度為60%。

圖4 乙醇濃度對(duì)玉米須黃酮提取率、酶抑制率的影響及提取總效果值Fig.4 Effect of ethanol concentration on the yield of flavonoids，the enzyme inhibition ratio and the extracting total effect value

2.1.4 液料比對(duì)玉米須總黃酮提取率以及酶抑制率的影響 從圖5可知，當(dāng)液料比小于20∶1(mL/g)時(shí)，其提取效果隨著液料比的增加而逐漸增大;當(dāng)液料比超過(guò)20∶1(mL/g)時(shí)，其提取效果反而下降。將黃酮提取率和酶抑制率分開來(lái)看，黃酮提取率隨著液料比的增加變化不大;黃酮提取率隨著液料比的增加變化顯著:當(dāng)液料比為20∶1(mL/g)時(shí)，酶抑制率效果最好。這是由于不同的黃酮化合物在溶劑中的溶解度不同，液料比為20∶1(mL/g)時(shí)所提取得到的黃酮化合物，其抗痛風(fēng)效果最好。綜合考慮后選取最適液料比為20∶1(mL/g)。

圖5 液料比對(duì)玉米須黃酮得率、酶抑制率的影響及提取總效果值Fig.5 Effect of liquid－solid ratio on the yield of flavonoids，the enzyme inhibition ratio and the extracting total effect value

2.2 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及分析

2.2.1 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。根據(jù)表2的結(jié)果，計(jì)算各項(xiàng)的回歸系數(shù)，以此建立綜合評(píng)分與微波功率、微波時(shí)間、乙醇濃度、液料比4個(gè)因子編碼值的數(shù)學(xué)回歸模型。

2.2.2 方差分析 方差分析結(jié)果見表3。

2.2.2.1 回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn) 將α值大于0.1的值剔除，得到優(yōu)化后的回歸方程為Y=19.53－0.67X3+0.80+0.92+1.01－1.26X1X2－1.19X3X4式(2)

2.2.2.2 回歸方程的檢驗(yàn) F回=3.55669＞F0.1(15，21)=1.8271475，顯著性良好，說(shuō)明該回歸模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值擬合程度較好。

表2 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Design and results of quadric regression orthogonal rotary test

2.2.2.3 回歸方程的失擬檢驗(yàn) Flf=5.06437＞F0.25(10，11)=3.902，說(shuō)明求得的實(shí)驗(yàn)方程擬合不太好，即失擬平方和除含有實(shí)驗(yàn)誤差、兩兩交互作用以及簡(jiǎn)單二次關(guān)系外，還有更高層次或者其它關(guān)系。

通過(guò)上述三項(xiàng)顯著性分析可知，回歸方程(1)的顯著性水平為0.1，擬合效果一般。

2.2.3 單因素效應(yīng)分析 采用降維分析法，將得到的回歸方程中四個(gè)因素任意三個(gè)固定在零水平，依次得各單因素的數(shù)學(xué)模型。

從圖6可以看出，四個(gè)因素中，除液料比隨著因素水平的變化對(duì)總提取效果值沒(méi)有太大的影響外，微波功率、微波時(shí)間以及乙醇濃度隨著因素水平的提高均增大。其中，微波功率在－2～0水平對(duì)提取總效果沒(méi)有太大影響。但在0～2水平，提取總效果隨著微波功率的增加呈明顯增加趨勢(shì);微波時(shí)間在－2～0水平逐漸增大時(shí)，提取總效果值緩慢增大;到微波時(shí)間為－0.5水平時(shí)，提取總效果值達(dá)到最大，而后逐漸降低;乙醇濃度在0水平對(duì)提取總效果影響最大。單因子變化趨勢(shì)與實(shí)驗(yàn)所做的單因素變化趨勢(shì)基本吻合，表明本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用二次正交旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)的可靠度比較高。

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis

表4 優(yōu)化方案中各變量取值的頻率分布Table 4 Frequency distributions of optimized parameter values

圖6 單因素效應(yīng)分析圖Fig.6 Effect of single factors

2.2.4 微波萃取條件的優(yōu)化 采用頻率分析法尋優(yōu)。利用DPS9.50進(jìn)行優(yōu)化，得率大于21.48%時(shí)，各變量取值的頻率分布如表4。

從表4可知，在95%的置信區(qū)間內(nèi)，微波功率的取值范圍為 597.2～623.9W;微波時(shí)間 9.842～10.158min;乙醇濃度為68.975%～70.34%;液料比為18.36～18.988(mL/g)。綜合考慮各種因素后，選取微波功率為600W，微波時(shí)間10min，乙醇濃度為70%，液料比為20∶1(mL/g)，在此條件下測(cè)得酶抑制率為39%，黃酮提取率為26%，則提取總效果值為35.1%。

3 結(jié)論

采用微波萃取方法對(duì)玉米須中抗痛風(fēng)活性組分進(jìn)行提取，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)以及二次旋轉(zhuǎn)正交組合優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，擬合了微波功率、乙醇濃度、液料比、微波時(shí)間四個(gè)因素對(duì)提取總效果的回歸模型，將實(shí)驗(yàn)結(jié)果量化處理。此外，通過(guò)方差分析還可以得到各因素對(duì)總體效果的影響程度依次為乙醇濃度＞微波功率＞微波時(shí)間＞液料比，為玉米須抗痛風(fēng)活性效果的進(jìn)一步開發(fā)研究提供了有力依據(jù)。但通過(guò)分析也可以看出該實(shí)驗(yàn)結(jié)果的擬合效果一般，若想得到準(zhǔn)確的數(shù)學(xué)模型還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

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