榛子葉中黃酮類化合物微波提取及純化的研究

趙明慧，姜子濤，李 榮

(天津商業(yè)大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津300134)

榛子葉為樺木科(Betulaceae)榛屬植物榛(Corylus heterophylla)的葉子，原產(chǎn)于我國，據(jù)考證迄今已有6000多年的歷史。我國榛的野生資源豐富，其中以平榛(Corylus heterophylla Fisch)分布較多而且普遍，在東北、華北、陜西、甘肅、山東、河南等地均有分布。榛具有廣泛的藥用價值，榛的果實可用于調(diào)中、開胃、明目，榛的雄花具有消炎、消腫、止痛等功效［1－2］。榛子葉中含有較豐富的黃酮類化合物，薛建飛［2］從平榛葉中分離鑒定出了山奈酚、山奈酚－3－O－β－D－吡喃葡萄糖苷等九種黃酮類化合物;Amaral等［3］利用 HPLC/DAD/ESI－MS/MS 法，從生長在葡萄牙的歐榛(Corylus avellana L.)葉中鑒定出了槲皮素－3－鼠李糖苷、山奈酚－3－鼠李糖苷等八種黃酮類化合物，但關于榛子葉黃酮提取和分離純化的研究尚未見報道。大孔樹脂由于其本身較大的比表面積和很好的網(wǎng)狀結構，與其他方法相比，具有吸附速率快、吸附性能好、生產(chǎn)周期短、可再生重復使用等優(yōu)點，已在食品、環(huán)保、醫(yī)藥等領域得到了廣泛的應用［4－5］。本文旨在研究大孔吸附樹脂分離純化榛子葉中黃酮類化合物的工藝條件，從而為綜合開發(fā)和利用我國榛子葉資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

榛子葉 采自天津薊縣;AB－8、D101、D4020、NKA－9、ADS－17、ADS－21、ADS－7 和 S－8 八種大孔吸附樹脂 南開大學化工廠;蘆丁標準品(分析純)北京化學試劑公司;甲醇(色譜純)天津市科密歐化學試劑有限公司;水 娃哈哈飲用純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司出品;其余試劑均為分析純。

U－3900紫外可見分光光度計 日本 Hitachi High－Technologies Corporation;MAS－1 微波快速制樣系統(tǒng) 上海新儀微波化學科技有限公司;722N可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;RE－52AA型旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;LGJ－10冷凍干燥機 北京松源華興科技發(fā)展有限公司;WE－3水浴恒溫振蕩器 天津市歐諾儀器儀表有限公司;高效液相色譜儀 Agilent 1100 Series;色譜柱 Agilent Zorbax SB－C18(250 × 4.6mm，5μm)。

1.2 實驗方法

1.2.1 微波輔助提取榛子葉粗黃酮 參照文獻的方法并適當改進［6］，具體為:將榛子葉洗凈烘干粉碎后，過80目篩。稱取5.0g榛子葉的干燥粉末，用55%(V/V)的乙醇溶液為溶劑，在料液比為1∶35(g∶mL)，微波溫度80℃、微波功率300W的條件下，微波萃取5min。提取液經(jīng)濾紙自然過濾、石油醚萃取三次，去掉石油醚層，再于旋轉蒸發(fā)儀中40～50℃減壓旋轉蒸發(fā)除去乙醇后，得到濃縮液，冷凍干燥后得到榛子葉粗黃酮的干燥粉末。

1.2.2 黃酮得率的測定 采用NaNO2－Al(NO3)3比色法［7－8］，得到蘆丁標準品濃度C與吸光度A關系的線性回歸方程:A=13.10857C－0.00205(相關系數(shù)R2=0.999)。并按照公式(1)計算總黃酮得率。

式中:C為由回歸方程計算的樣品液總黃酮濃度(mg/mL);V提取液體積(mL);N為稀釋倍數(shù);W為榛子葉粉末質量(g)。

1.2.3 榛子葉黃酮樣品液的制備 準確稱取0.2500g榛子葉粗黃酮粉末，用蒸餾水溶解、定容至250mL容量瓶中，即得濃度為1.0mg/mL的榛子葉粗黃酮儲備液，作為樣品液備用。

1.2.4 大孔吸附樹脂的預處理 參照文獻的方法［9］，將八種大孔樹脂用95%的乙醇溶液充分浸泡24h后，用蒸餾水洗至無乙醇味。然后用5%的HCl溶液浸泡3h，用蒸餾水洗至 pH為中性。再用5%的NaOH溶液浸泡3h，用蒸餾水洗至pH為中性，最后用蒸餾水浸泡備用。

1.2.5 大孔樹脂的篩選——靜態(tài)法

1.2.5.1 大孔樹脂的靜態(tài)吸附與解析性能 準確稱取處理后的八種大孔樹脂各1.00g于50mL的具塞三角瓶中，分別加入20.0mL濃度為1.0mg/mL的樣品液，在室溫下水浴振蕩24h(頻率為130r/min)，待樹脂充分吸附后，分別測定八種大孔樹脂吸附后的上清液的吸光度值，并按公式(2)計算各樹脂對榛子葉粗黃酮的吸附率。

將上述吸附且用水洗凈后的八種大孔樹脂分別用20.0mL 70%的乙醇溶液浸泡，在室溫下水浴振蕩12h(頻率為130r/min)，分別測定八種大孔樹脂解吸液的吸光度值，并按公式(3)計算各樹脂的解吸率。

式中:A0為樣品液在328nm的吸光度;Ae為吸附后上清液在328nm的吸光度;Ad為解吸液在328nm的吸光度。

1.2.5.2 大孔樹脂靜態(tài)吸附動力學曲線的測定 在裝有2.00g D101型大孔樹脂的具塞三角瓶中加入40.0mL濃度為1.0mg/mL的樣品液，于室溫下水浴振蕩，每隔15min測定一次上清液的吸光度，并按公式(4)計算樹脂的吸附量，繪制D101型大孔樹脂的靜態(tài)吸附動力學曲線。

式中:A0為樣品液在328nm的吸光度;Ae為吸附后上清液在328nm的吸光度;C0為樣品液濃度(mg/mL);V為樣品液體積(mL);W為樹脂質量(g)。

1.2.6 榛子葉黃酮純化條件的確定——動態(tài)法

1.2.6.1 樣品液流速的確定 準確稱取1.2.4方法處理后的D101型大孔樹脂6.00g，采用濕法裝柱的方法裝入玻璃層析柱中，分別將濃度為1.0mg/mL的樣品液以1、2、3BV/h的流速加入到樹脂柱中，每隔4.0mL收集一次流出液，并測定其吸光度，以泄漏點出現(xiàn)最遲為最佳(泄漏點指該處黃酮流出液的吸光度為樣品液吸光度的1/10)，研究不同樣品液流速對樹脂吸附效果的影響。

1.2.6.2 樣品液pH的確定 將濃度為1.0mg/mL，pH分別為2、4、6的樣品液以2BV/h的流速加入到樹脂柱中，每隔4.0mL收集一次流出液，并測定其吸光度，以泄漏點最遲為最佳，研究不同樣品液pH對樹脂吸附效果的影響。

1.2.6.3 解吸液pH和解吸液體積的確定 將濃度為1.0mg/mL、pH=4的樣品液以2BV/h的流速加入樹脂柱中，待吸附達到泄漏點后停止加樣。分別用pH為2、4、6的70%乙醇溶液以2BV/h的流速進行解吸，每隔4.0mL(0.5BV)收集一次流出液，并測定其吸光度，繪制解吸曲線。同時收集不同pH下的解吸液，按公式(5)計算解吸率。

式中:C0為樣品液濃度(mg/mL);V為樣品液體積(mL);Q為靜態(tài)吸附量(mg/g);W為樹脂質量(g)。

1.2.6.4 解吸液乙醇濃度的確定 將濃度為1.0mg/mL、pH=4的樣品液以2BV/h的流速加入樹脂柱，待吸附達到泄漏點后停止加樣。分別用不同濃度pH4的乙醇溶液以2BV/h的流速進行解吸，收集60%、70%和80%乙醇濃度的解吸液，將解洗液稀釋5倍，分別掃描不同乙醇濃度解吸液在200～500nm波長范圍內(nèi)的吸收光譜，研究乙醇濃度對解吸效果的影響。

1.2.7 大孔樹脂純化效果的檢驗——HPLC法 根據(jù)1.2.6方法確定的最佳條件純化榛子葉粗黃酮，將收集的純化液旋轉蒸發(fā)除去乙醇后，冷凍干燥得到純化后的榛子葉黃酮粉末。分別用30%的甲醇溶液配制1.0mg/mL純化前和純化后的黃酮溶液，在相同的梯度條件下用HPLC進行檢測。HPLC流動相為甲醇(A)、水(B)和5%乙酸水溶液(C)，流速為0.8mL/min，進樣量為5μL;梯度條件為0～5min:30%～45%A;5～25min:45%～80%A;5%乙酸水溶液(C)一直保持10%。檢測波長為270nm。

2 結果與討論

2.1 微波輔助提取榛子葉黃酮最佳提取條件的確定

2.1.1 乙醇濃度的確定 根據(jù)方法1.2.1，在其他提取條件不變的情況下，考察不同乙醇濃度對黃酮得率的影響，結果如圖1所示。

圖1 乙醇濃度對榛子葉黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on flavonoids extraction

由圖1可知，隨著乙醇濃度的增加，黃酮的得率先增大再減小，乙醇溶液的濃度為55%(V/V)時得率最高。這是因為，黃酮由于分子上帶有酚羥基和糖苷鏈而具有一定的極性和親水性，根據(jù)“相似相溶”原理，黃酮易溶于中極性和極性偏強的溶劑中，但當乙醇濃度超過55%時，溶劑極性相對偏低，并且乙醇濃度過高會促使細胞內(nèi)的蛋白質凝固，不利于黃酮溶出［10］。

2.1.2 料液比的確定 根據(jù)方法1.2.1，在其他提取條件不變的情況下，考察不同料液比對黃酮得率的影響，結果如圖2所示。

圖2 料液比對榛子葉黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ratio of material to liquid on flavonoids extraction

由圖2可知，隨著料液比的增加，黃酮的得率先增大再減小。這是因為料液比的增加有利于黃酮的溶出，但如果料液比過大，會影響到物料對微波能量的吸收，導致黃酮得率下降。圖2表明料液比為1∶35(g∶mL)時黃酮得率最高。

2.1.3 微波提取溫度的確定 根據(jù)方法1.2.1，在其他提取條件不變的情況下，考察不同微波溫度對黃酮得率的影響，結果如圖3所示。

圖3 微波溫度對榛子葉黃酮得率的影響Fig.3 Effect of temperature on flavonoids extraction

由圖3可知，隨著微波溫度的升高，黃酮得率先增大再減小，溫度為80℃時得率最高。這是因為，隨著溫度的升高，黃酮在乙醇中的溶解度會增大，但溫度過高會破壞甚至溶解黃酮分子。

2.1.4 微波功率和時間的確定 根據(jù)方法1.2.1，在其他提取條件不變的情況下，考察不同微波功率和時間對黃酮得率的影響，結果如圖4所示。

圖4 微波功率和時間對黃酮得率的影響Fig.4 Effect of the microwave power and extract time on flavonoids extraction

由圖4可知，在相同的微波功率下，黃酮的得率隨著時間的增加先增大后減小，這是因為加熱時間過短，黃酮未能完全溶出;而加熱時間過長會使黃酮分解，不利于黃酮的提取。此外，微波功率過大，黃酮吸收的能量過多，溫度劇烈增大，會促使黃酮分解。根據(jù)實驗結果選擇微波功率為300W，微波時間為5min。

2.2 大孔吸附樹脂的篩選

2.2.1 大孔樹脂的靜態(tài)吸附與解吸性能的比較 根據(jù)方法1.2.5.1，共考察了八種大孔樹脂對榛子葉黃酮的吸附性能和解吸性能，結果如表1所示:

不同類型的大孔樹脂因其化學結構不同，對黃酮的吸附能力也有所差別。理論上，不同類型的大孔樹脂對物質的吸附能力主要取決于樹脂的極性、比表面積和孔徑大小等因素［11］。從表1可以看出，解吸率最高的D101型樹脂的比表面積高于其它型號的樹脂且平均孔徑較大，與理論相符。盡管D101型大孔樹脂的吸附率略低于 ADS－7、S－8和ADS－21，但考慮吸附率和解吸率兩方面因素，選用D101型大孔樹脂對榛子葉粗黃酮進行分離純化。

表1 八種大孔樹脂的吸附率與解吸率Table 1 The adsorption and desorption ratios of different macroporous resins

2.2.2 大孔樹脂靜態(tài)吸附動力學曲線 大孔樹脂是一種新型的純化材料，可大大縮短生產(chǎn)周期，提高生產(chǎn)率［12］。根據(jù)方法1.2.5.2，得到D101型大孔樹脂靜態(tài)吸附動力學曲線，結果如圖5所示。

圖5 D101大孔樹脂的靜態(tài)吸附動力學曲線Fig.5 Kinetic curve of static adsorption of D101 resin

由圖5可知，在開始的15min內(nèi)，樹脂的吸附量快速增大，在15～90min內(nèi)，樹脂吸附量增加的速度變慢，當吸附時間達到90min以后，樹脂的吸附量基本保持不變，樹脂接近飽和。這說明D101大孔樹脂對榛子葉黃酮的吸附為快速平衡型，與理論相符。此時根據(jù)公式(4)計算得到D101型大孔樹脂對榛子葉中黃酮類化合物的最大吸附容量為16.8mg/g。

2.3 榛子葉黃酮純化條件的確定——動態(tài)法

2.3.1 樣品液流速對大孔樹脂吸附的影響 樣品液流速是影響樹脂吸附效果的主要因素之一。根據(jù)方法1.2.6.1，得到樣品液流速與大孔樹脂吸附效果之間的關系，結果如圖6所示。

由圖6可知，樣品液流速為1BV/h和2BV/h時，泄露點出現(xiàn)較晚，分別在33mL和31mL。而流速為3BV/h時，泄露點出現(xiàn)最早為26mL。這是因為樣品液流速過快會影響到黃酮分子與大孔樹脂的吸附作用，黃酮分子在樹脂表面附著較多未能完全擴散到樹脂孔內(nèi)，極易隨樣品液流出，從而使樹脂的吸附能力下降;如果流速過小，樹脂的吸附時間過長［13］。因此，綜合考慮樹脂的吸附能力和吸附時間，選擇樣品液流速為2BV/h。

圖6 樣品液流速對D101樹脂吸附效果的影響Fig.6 The effect of adsorption velocity on the adsorption efficiency of D101 resin

2.3.2 樣品液pH對大孔樹脂吸附的影響 樣品液pH是影響大孔樹脂分離純化效果的重要因素。根據(jù)方法1.2.6.2，得到樣品液pH與大孔樹脂吸附效果之間的關系，結果如圖7所示。

圖7 樣品液pH對D101樹脂吸附效果的影響Fig.7 The effect of pH on the adsorption efficiency of D101 resin

由圖7可知，D101大孔樹脂在樣品液pH為4時的吸附能力最強，隨著pH的增大和減小都不利于其對黃酮類化合物進行吸附。這是因為黃酮類化合物因其結構上具有酚羥基而帶有一定的酸性，并且黃酮類化合物的酸性大小與酚羥基的位置和數(shù)目有關［14］。在弱酸性條件下黃酮能以分子形式存在，與樹脂產(chǎn)生范德華力而被吸附;如果酸性過強，黃酮會與溶液中的氫離子結合形成佯鹽［15］，黃酮主要以離子形式存在，從而不利于大孔樹脂的吸附。所以最終確定樣品液pH 4為宜。

2.3.3 解吸液pH和解吸液體積對大孔樹脂解吸的影響 根據(jù)方法1.2.6.3，得到不同pH解吸液的解吸曲線和解吸率，如圖8、圖9所示。

圖8 不同pH解吸液的解吸曲線Fig.8 The desorption curve of different pH

圖9 不同pH解吸液的解吸率Fig.9 The desorption rates at different pH values

由圖8、圖9可知，當pH為4時，解吸曲線峰型最高且無拖尾現(xiàn)象，解吸率最高為96.8%;pH為2時，黃酮的解吸率最低，同時反映到解吸曲線上表現(xiàn)為解吸峰型最低。并且，從圖8可以看出，pH為2、4、6時解吸液體積均為3BV，故應選擇pH為4的3BV乙醇溶液為解吸液。

2.3.4 解吸液乙醇濃度對大孔樹脂解吸的影響 根據(jù)方法1.2.6.4，得到不同乙醇濃度解吸液的紫外吸收曲線，如圖10所示。

圖10 不同乙醇濃度解吸液的紫外吸收曲線Fig.10 The UV absorption of different concentrations of eluate

由圖10可知，當乙醇濃度為70%時，解吸出的黃酮最多，且解吸液的整體峰型與樣品液相比基本沒有發(fā)生變化。這是因為，大孔樹脂分離純化的原理是依據(jù)被吸附物質和樹脂的極性來決定的。因此，解吸液乙醇濃度的大小應根據(jù)黃酮和樹脂之間的吸附力來決定。故選擇最佳的解吸乙醇濃度為70%。

2.4 大孔樹脂純化效果的分析

根據(jù)方法1.2.7，得到D101型大孔樹脂純化前后榛子葉黃酮在270nm下的高效液相色譜圖，結果如圖11所示。

圖11 D101大孔樹脂處理前后270nm下榛子葉黃酮的HPLC圖Fig.11 HPLC profile of the flavonoids of the Corylus heterophylla leaves monitored at 270 nm by D101 resin

通過圖11可以看出，經(jīng)D101大孔樹脂純化后的榛子葉黃酮色譜峰響應值比相同濃度純化前的略有增加，且10.000、12.544、13.057min 處，純化后色譜峰的響應值增加了1.6、1.3、1.5倍;同時，對比純化前后的HPLC圖還可發(fā)現(xiàn)，2.969min處純化前沒有分開的山包狀色譜峰在純化后變?yōu)榱藘蓚€明顯分開、形狀尖銳的色譜峰;7.501min處純化前的雜質峰在純化后已經(jīng)沒有。這表明D101大孔樹脂對榛子葉黃酮起到了純化作用。

3 結論

利用單因素實驗對微波輔助法提取榛子葉黃酮的主要因素進行了研究，確定了最佳提取條件是:乙醇濃度為 55%(V/V)，料液比為 1∶35(g∶mL)，微波溫度80℃，微波功率300W，提取時間5min。

本實驗通過靜態(tài)吸附和解吸實驗，從八種大孔樹脂中篩選出了比較適合用于純化榛子葉中黃酮類化合物的樹脂類型，確定了D101型大孔樹脂是分離純化榛子葉黃酮的最佳樹脂，其不僅具有較高的解吸率，而且吸附速率快、生產(chǎn)效率高;同時，通過動態(tài)實驗確定了D101型大孔樹脂純化榛子葉黃酮的最佳工藝參數(shù)為:樣品液流速為2BV/h、樣品液pH4、解吸液pH4，解吸液乙醇濃度為70%。HPLC分析結果證明:該方法用于純化榛子葉黃酮具有可行性，經(jīng)純化后的榛子葉黃酮含量提升至54.7%。

本研究初步建立了微波法提取榛子葉黃酮和大孔樹脂純化榛子葉黃酮的工藝參數(shù)，為榛子葉資源量為75.9%，高出國標要求10.9%，其余指標也均基本符合國家標準要求。

表6 果膠質量指標測定結果Table 6 The results of pectin quality index determination

3 結論

實驗結果表明可以實現(xiàn)蘋果皮中多酚和果膠的連續(xù)化生產(chǎn)，確定了蘋果皮渣多酚超聲輔助提取的回歸數(shù)學模型，最優(yōu)提取工藝條件:料液比1∶20(g/mL)，提取溫度63℃，提取液乙醇濃度60%，提取時間為58min，此條件下多酚的提取量高達18.29mg/g，多酚純度達到52.56%;并且確定了離子交換樹脂輔助酸解法提取蘋果皮果膠的最佳條件:樹脂用量為11%，pH為1.3，提取時間2.0h，提取溫度75℃，料液比1∶24(g/mL)，此條件下果膠得率高達26.26%，此得率比大部分同類研究的結果高出很多。說明從蘋果皮中連續(xù)提取和分離多酚、果膠的工藝具有良好的工業(yè)化生產(chǎn)潛力，應用前景廣闊。

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