環(huán)糊精抑制脂肪氧合酶活性的影響因素探究

王金鵬，李奕璇，任琴琴，金征宇

(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學食品學院，江蘇無錫214122)

大豆脂肪氧合酶能夠催化多不飽和脂肪酸解產生醛、酮等氧化產物，給食品的風味、口感等帶來不良的影響。目前最常用的去除大豆脂肪氧合酶活性的方法就是加熱鈍酶法［1］，但這將導致蛋白質溶出率偏低、蛋白功能特性降低、產生不良風味、大豆蛋白溶解度下降，降低食品營養(yǎng)價值等問題［2］。另有相關報道采用環(huán)糊精抑制脂肪氧合酶催化過程，如Estrella等［3］研究了環(huán)糊精能包埋外源底物從而使其的氧化反應受到抑制;Roque Bru［4］研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)糊精的加入使酶催化反應的速率降低。但是這些報道普遍認為環(huán)糊精空腔包埋了底物亞油酸分子，從而致使酶催化氧化受抑制，但從環(huán)糊精－酶超分子體系來看，環(huán)糊精能直接與相關酶發(fā)生作用［5］。例如Punpeng等人［6］發(fā)現(xiàn)環(huán)糊精抑制α－淀粉酶分子對生淀粉的降解消化能力，于博等人發(fā)現(xiàn)β－環(huán)糊精能夠競爭性的抑制普魯蘭酶的催化活性［7］。因此本文提出假設——環(huán)糊精能夠直接抑制脂肪氧合酶的活性，在假設基礎上研究影響環(huán)糊精抑制LOX酶活的因素，這對于揭開環(huán)糊精抑制脂肪氧合酶催化的影響機制、明確環(huán)糊精在脂肪氧合酶催化氧化反應中的作用提供了重要的依據(jù)，為環(huán)糊精與某些催化酶類相互作用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

β－ CD、H3BO3、Na2B4O7·10H2O、吐溫 －20、NaOH、HCL、無水乙醇 均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司;脂肪氧合酶(LOX－1，EC，Type I－S，46000U/mg)、亞油酸(LA，純度≥98%)均購于Sigma－Aldrich(上海)貿易有限公司。

電子天平 梅特勒－托利多儀器有限公司;Delta320pH計 梅特勒－托利多儀器有限公司;移液槍 BeyonLab Scientific Instrument(上海);TU－1900雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 脂肪氧合酶活性的測定 采用分光光度法對脂肪氧合酶的活性進行測定，具體步驟如下:在25℃，pH為9.0條件下，以亞油酸為底物的3mL反應體系在234nm處每分鐘增加0.001吸光度值定義為一個酶活單位。取500μL酶液移入2.5mL的底物溶液中，混勻后于25℃水浴中恒溫4min，用5mL無水乙醇終止反應，混勻后測定反應液在234nm處的吸光度?？瞻讟訛?.5mL酶液中加入5mL無水乙醇，再加入2.5mL底物溶液，于25℃水浴恒溫4min。

1.2.2 環(huán)糊精抑制脂肪氧合酶活性的驗證實驗 酶反應在25℃，通過改變環(huán)糊精、酶液和亞油酸三者的添加順序來進行驗證:

a.取500μL酶液于試管中，加入1.44mL緩沖液，然后加入1mL環(huán)糊精溶液，充分混勻，反應4min后，再加入60μL亞油酸，混勻，反應4min后，加入5mL無水乙醇終止反應。于234nm處1cm光程的石英比色皿中測吸光度。

b.取1mL環(huán)糊精于試管中，加入1.44mL緩沖液，再加入60μL亞油酸，充分混合，4min后加入500μL酶液，4min后加入5mL無水乙醇終止反應。于234nm處測吸光度。

c.將1mL環(huán)糊精、1.44mL緩沖液、500μL酶液和60μL亞油酸同時加入試管，反應8min后終止。于234nm處測吸光度。

d.不加環(huán)糊精，取500μL酶液，加入2.44mL緩沖溶液，混勻，加入60μL亞油酸，反應8min后，加入5mL無水乙醇，終止反應。于234nm處測吸光度。

1.2.3 環(huán)糊精抑制脂肪氧合酶活性的單因素實驗

環(huán)糊精抑制脂肪氧合酶催化氧化活性的實驗主要受溫度、pH、環(huán)糊精濃度以及Fe3+、Fe2+的濃度的影響，實驗方法為:

取500μL酶液，加入1mL環(huán)糊精，1.44mL的緩沖溶液，在水浴中反應30min后，加入60μL亞油酸，反應 4min后，加入5mL無水乙醇終止反應，于234nm處測吸光度。

1.2.3.1 溫度影響 pH9，環(huán)糊精濃度為10mmol/L時，不添加 Fe3+和 Fe2+，研究 5、10、15、20、25、30、35、40、45℃水浴下，環(huán)糊精對脂肪氧合酶的抑制效果的影響趨勢。

1.2.3.2 pH影響 在25℃，環(huán)糊精濃度為10mmol/L時，不添加 Fe3+和 Fe2+，研究 pH4、5、6、7、8、9、10、11、12時，環(huán)糊精對脂肪氧合酶的抑制效果的影響趨勢。

1.2.3.3 環(huán)糊精濃度影響 25℃下pH為9時，不添加 Fe3+和 Fe2+，研究環(huán)糊精濃度為 10、1、0.01、1 ×10－4、1 ×10－6、1 ×10－8、1 ×10－12mmol/L 時，環(huán)糊精對脂肪氧合酶的抑制效果的影響趨勢。

1.2.3.4 Fe3+濃度影響 25℃下pH9，環(huán)糊精濃度為10mmol/L 時，不添加 Fe2+，研究 Fe3+濃度為0.5、0.1、0.05、0.01、0.005μmol/L 時，環(huán)糊精對脂肪氧合酶的抑制效果的影響趨勢。

1.2.3.5 Fe2+濃度影響 25℃下，pH9，環(huán)糊精濃度為10mmol/L 時，不添加 Fe3+，研究 Fe2+濃度為0.5、0.1、0.05、0.01、0.005μmol/L 時，環(huán)糊精對脂肪氧合酶的抑制效果的影響趨勢。

1.2.4 正交實驗 根據(jù)單因素實驗的結果，對溫度、pH、環(huán)糊精濃度、Fe3+濃度和Fe2+濃度這五個因素三個水平進行L18(35)正交實驗。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

利用SPSS軟件(19.0英文版)對實驗結果進行極差分析及方差分析，判斷顯著因素［8］。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析與處理 本實驗數(shù)據(jù)中紫外分析數(shù)據(jù)均為4次重復6次平行，熒光光譜和圓二色譜數(shù)據(jù)均為3次重復3次平行，使用OriginPro 8.5進行數(shù)據(jù)分析和圖形繪制。

2 結果與討論

2.1 環(huán)糊精抑制脂肪氧合酶活性的驗證實驗

從圖1中可以看出，與對照組相比，環(huán)糊精的添加能夠抑制脂肪氧合酶的活性，且添加次序造成對LOX的抑制程度也不同:先加環(huán)糊精和酶作用一段時間后再加底物的抑制率(a)最大，三者一起加入的抑制率次之(c)，而先讓環(huán)糊精與底物充分作用最后加入酶溶液的抑制率最小(b)。由此可知，環(huán)糊精存在的條件下，脂肪氧合酶催化氧化亞油酸的反應受到抑制的原因，除了環(huán)糊精包合底物亞油酸之外，環(huán)糊精還能與脂肪氧合酶直接發(fā)生相互作用，并且與環(huán)糊精包合底物抑制催化反應相比，環(huán)糊精與脂肪氧合酶發(fā)生作用從而抑制反應的程度更大，占主導地位。

圖1 β－CD的不同添加順序對脂肪氧合酶的作用Fig.1 Comparison of inhibition effects of different β－cyclodextrins on the catalytic oxidation of linoleic acid by lipoxygenase in three different adding arrangements

2.2 環(huán)糊精抑制脂肪氧合酶活性的單因素實驗

2.2.1 反應體系溫度對環(huán)糊精抑制效果的影響 從圖2中可以看出，隨著溫度升高，環(huán)糊精抑制脂肪氧合酶催化亞油酸氧化的作用增強，升到40℃時，氫過氧化物的含量開始明顯減少。原因可能是溫度升高使酶分子結構變得松散，氨基酸殘基的暴露程度增大，有利于環(huán)糊精空腔與更多的疏水性氨基酸殘基發(fā)生復合作用，從而抑制了脂肪氧合酶的活性。

圖2 溫度對環(huán)糊精抑制脂肪氧合酶氧化活性的影響Fig.2 Effect of temperature on the inhibition of lipoxygenase by β－cyclodextrins

2.2.2 pH對環(huán)糊精抑制效果的影響 由圖3可以看出，隨著pH的升高，環(huán)糊精對脂肪氧合酶的抑制作用呈先減弱后增強的趨勢，當pH9時，環(huán)糊精對脂肪氧合酶的抑制作用最弱。這可能是因為脂肪氧合酶的催化反應塑料最大時pH為9～10，隨著pH的變化，酶分子活性中心基團解離程度發(fā)生變化，進而導致酶分子的活性構象發(fā)生變化［9］，該變化將影響環(huán)糊精與脂肪氧合酶的結合程度。

圖3 pH對環(huán)糊精抑制脂肪氧合酶氧化活性的影響Fig.3 Effect of pH on the inhibition of lipoxygenase by β－cyclodextrins

2.2.3 環(huán)糊精濃度對環(huán)糊精抑制效果的影響 由圖4可以看出，隨環(huán)糊精濃度的減少，環(huán)糊精對脂肪氧合酶催化氧化活性的抑制作用也在減弱，這可能是因為低濃度時，β－CD與脂肪氧合酶分子的相互作用較弱不致于引起酶分子的活性構象的變化;隨著β－CD濃度的增加，能夠與脂肪氧合酶分子相互作用的疏水性空腔不斷增加，使得兩者的相互作用增強，改變了酶分子的活性構象，從而抑制了酶的催化活性。

2.2.4 Fe3+和 Fe2+濃度對環(huán)糊精抑制效果的影響 在脂肪氧合酶中，鐵以兩種形態(tài)存在:Fe3+和Fe2+，其中 Fe3+是活化態(tài)，F(xiàn)e2+是非活化態(tài)，F(xiàn)e2+只有轉變成Fe3+才具有催化活性。

Fe3+濃度和Fe2+濃度對環(huán)糊精抑制作用的影響結果如圖5所示。

由圖5可以看出同濃度下，F(xiàn)e2+的抑制作用優(yōu)于Fe3+，這可能是因為適量的外源Fe3+通過電子傳遞促進了脂肪氧合酶催化中心Fe2+向Fe3+的轉化，促進酶促反應進行［10］。

2.3 各因素對環(huán)糊精抑制效果影響的正交實驗

根據(jù)表1所設的因素水平表進行正交實驗設計如表2所示，結果分析如表3所示。

圖4 環(huán)糊精濃度對環(huán)糊精抑制脂肪氧合酶氧化活性的影響Fig.4 Effect of decreasing concentrations of β－CD on the inhibition of lipoxygenase by β－cyclodextrins

圖5 Fe3+和Fe2+對環(huán)糊精抑制脂肪氧合酶氧化活性的影響Fig.5 Effects of decreasing concentrations of Fe3+and Fe2+on the inhibition of lipoxygenase by β－cyclodextrins

表2 正交實驗結果Table 2 The results of five factors and three levels orthogonal experiments

方差分析結果表明，因素C高度顯著，因素B顯著，因素D、E、A不顯著。環(huán)糊精濃度為10mmol/L，反應溫度在35℃，反應 pH 為 4，F(xiàn)e3+濃度0.005μmol/L，F(xiàn)e2+濃度0.01μmol/L時，環(huán)糊精抑制脂肪氧合酶活性能力最高，在該實驗條件下測定到的吸光值為0.118，經計算環(huán)糊精對脂肪氧合酶的抑制率達到86.26% 。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

3 結論

環(huán)糊精能夠直接作用脂肪氧合酶從而抑制其活性;在環(huán)糊精濃度為10mmol/L，反應溫度在35℃，反應 pH 為 4，F(xiàn)e3+濃度在 0.005μmol/L，F(xiàn)e2+濃度在0.01μmol/L時，環(huán)糊精抑制脂肪氧合酶活性能力最佳，抑制率達到86.26%。

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