重疊延伸PCR技術(shù)構(gòu)建β-環(huán)糊精葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因的定點突變原核表達載體

王 華，文 一，于寒松，樸春紅，王玉華，劉俊梅，胡耀輝，*

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼028000;2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，吉林長春130118;3.環(huán)境保護部環(huán)境規(guī)劃院，北京100012)

β－環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(β－CGTase)屬于α－淀粉酶家族，可以作用于淀粉的葡萄糖單位通過α－1，4－糖苷鍵連接而生成 β－環(huán)糊精(β－CD)。β－CD的化學(xué)結(jié)構(gòu)具有非極性空穴和外親水的特點，常被用作分子膠囊和乳化劑，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品、農(nóng)藥等領(lǐng)域［1－2］。

β－CGTase是催化淀粉發(fā)生環(huán)化反應(yīng)生成β－CD的關(guān)鍵酶，但是酶法生產(chǎn)由于酶活性的影響使得產(chǎn)率低［3］。近年來，基因工程定點突變技術(shù)廣泛應(yīng)用于酶的體外改造中，通過改變酶的基因序列來改變酶與底物的結(jié)合能力，從而改變酶的活性。Shin Hyun－Dong等［4］人利用定點突變技術(shù)將 β－CGTase基因中W652突變成G，結(jié)果表明酶的環(huán)化活性增強而水解及偶合活性降低。通過對來自B，circulans 251中的環(huán)糊精轉(zhuǎn)移酶進行突變Ala230Val，使該酶的水解活性提高而環(huán)化活性降低［5］。重疊延伸 PCR技術(shù)(overlap extension PCR)是1989年Horton等人建立的一種PCR擴增方法［6］，它通過寡聚核苷酸鏈之間相互重疊的部分搭橋，互為模板，通過多次PCR擴增，從而獲得目的DNA基因片段的方法。重疊延伸PCR技術(shù)可以準(zhǔn)確、高效地擴增DNA片段，尤其在進行定點突變時可以提高突變效率，并且不受突變位置及突變類型的限制［7］。本實驗通過在SWISSMODEL上建模，根據(jù)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，考慮到β－CGTase屬于α－淀粉酶家族，其基因序列C端的保守區(qū)是與淀粉酶的特異性和穩(wěn)定性有關(guān)，不影響酶活性質(zhì)，因此將N端典型保守區(qū)域氨基酸殘基進行改變，從而改變突變位點的疏水性及其空間結(jié)構(gòu)［8］，分析得到β－CGTase保守區(qū)內(nèi)可能影響到酶環(huán)化活性的二個關(guān)鍵位點 Y127和 R254，采用重疊延伸PCR技術(shù)進行定點突變，為β－CGTase環(huán)化活性的提高提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

表1 重疊延伸PCR的引物Table 1 Primer pairs of overlap extension PCR

表2 引物配對和PCR產(chǎn)物Table 2 Primer pairs and production of PCR

1.1 材料與儀器

菌株Escherichia coli BL21(DE3)上海光明乳業(yè)有限公司技術(shù)中心惠贈;重組表達質(zhì)粒 pET－28b::CGTase 上述技術(shù)中心構(gòu)建;Primer STAR HS和Taq聚合酶、克隆載體pMD18－T Simple、表達載體pUC－18，T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶 HindⅢ和KpnⅠ 均購自TaKaRa公司;氨芐青霉素貯存液 氨芐青霉素 北京鼎國，用無菌超純水配成100mg/mL，分裝，－20℃凍存，使用時每1mL培養(yǎng)基加入lμL，終濃度為100μg/mL;常規(guī)化學(xué)試劑 均為國產(chǎn)分析純試劑;液體 LB 培養(yǎng)基［9］1.0% 胰蛋白胨，1.0%NaCl，0.5%酵母浸出物，加蒸餾水充分溶解后，定容至1L，分裝，高壓蒸汽滅菌118℃，20min。

PCR擴增儀 ABI，Applied Biosystems;凝膠成像系統(tǒng) DNr MiniBis pro。

1.2 實驗方法

1.2.1 重疊延伸PCR 擴增原理［10］如圖1所示，F(xiàn)1和R2與原模板完全匹配，F(xiàn)2和R1是引入的突變位點，并且具有12個以上相匹配的互補堿基。以O(shè)RF為模板，用引物F1和R1，F(xiàn)2和R2分別擴增得到ORF－1和 ORF－2，再以 ORF－1和 ORF－2 混合物為模板，用引物F1和R2擴增得到突變的基因序列。

圖1 重疊延伸PCR原理Fig.1 Principle of overlap extension PCR

1.2.2 引物 根據(jù) β－CGTase基因和2個突變氨基酸相應(yīng)位點及其兩側(cè)的堿基序列，用軟件 Primer premier 5.0設(shè)計一對β－CGTase的引物和2對突變引物，如表1。

1.2.3 PCR 擴增 第一輪 PCR:以質(zhì)粒 pET－28b::CGTase為模板，根據(jù)重疊延伸PCR的反應(yīng)原理，設(shè)定擴增ORF－1和ORF－2片段程序:94℃ 5min;94℃45s，55℃ 45s，72℃ 90s，35 個循環(huán);72℃ 10min;4℃保溫。

第二輪PCR:以 ORF－1和 ORF－2混合物為模板，擴增得到突變的基因片段程序:94℃ 5min;94℃45s，55℃ 45s，72℃ 2min，35 個循環(huán);體系中加入 Taq聚合酶，72℃ 30min;4℃保溫［11］。

1.2.4 突變目的基因的鑒定 PCR擴增后，取5μL PCR產(chǎn)物用于1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 克隆載體的轉(zhuǎn)化與鑒定 鑒定正確的突變基因使用TIGEN膠回收試劑盒進行PCR產(chǎn)物純化回收，經(jīng)過純化的產(chǎn)物與pMD18－T Simple載體連接。利用熱擊法將克隆載體轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α中，在含有終濃度為100μg/mL氨芐青霉素的LB平板上進行藍(lán)白斑篩選，挑取白色單菌落進行液體擴大培養(yǎng)，經(jīng)過菌液PCR檢測及質(zhì)粒雙酶切鑒定片段大小正確后，將陽性菌株送上海生工進行基因測序。

1.2.6 原核表達載體的構(gòu)建 將已確認(rèn)的pMD18－T重組質(zhì)粒和pUC－18表達載體用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和HindⅢ分別進行雙酶切，純化回收目的基因和表達載體并使用T4 DNA連接酶將其連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli BL 21(DE3)，在含有終濃度為100μg/mL氨芐青霉素的LB平板上進行藍(lán)白斑篩選，得到陽性菌株，進行酶切鑒定和DNA序列測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 PCR擴增結(jié)果

2.1.1 第一輪PCR:ORF－1和ORF－2片段擴增 用適當(dāng)稀釋的質(zhì)粒pET－28b::CGTase為模板，以表2所示的引物進行配對PCR擴增，分別獲得相應(yīng)的PCR產(chǎn)物。經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果與預(yù)計相符，并且沒有非特異性條帶，結(jié)果如圖2所示。

2.1.2 第二輪PCR突變基因片段擴增 第一次獲得的各突變體的ORF－1和ORF－2基因片段純化后經(jīng)適當(dāng)稀釋等量混合作為模板，用引物F1/R2進行擴增，經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳檢測，產(chǎn)物大小均為2139bp，且無非特異性條帶，結(jié)果與預(yù)計相符，如圖3。

2.2 PCR產(chǎn)物鑒定

與T－vector連接后轉(zhuǎn)化到 E.coil DH5α 中，經(jīng)過菌液PCR鑒定，結(jié)果正確后再提取質(zhì)粒，用HindIII和Kpn I進行雙酶切(圖4)，酶切片段大小正確，再進行測序鑒定。

圖2 不同突變體的ORF－1和ORF－2片段擴增電泳分析Fig.2 Electrophoresis of ORF－1 and ORF－2 amplified fragment of different mutants

圖3 不同突變體的突變基因片段擴增電泳分析Fig.3 Electrophoresis of the amplified fragment of different mutants

圖4 突變體雙酶切鑒定Fig.4 Restriction enzyme digestion of the mutants

2.3 克隆載體的測序分析

利用clustalx1.81對原基因β－CGTase蛋白序列和二個突變體Y127F，R254F的蛋白序列進行多序列比對，所獲得突變基因是預(yù)先設(shè)計的定點突變(圖5)，表明β－CGTase突變體構(gòu)建成功同時也說明了overlapPCR技術(shù)是一種簡便且有效的定點突變方法。

2.4 原核表達載體的構(gòu)建

圖5 β－CGTase基因序列與突變基因序列多重序列比較Fig.5 Multiple alignment of the amino－acid sequences of β－CGTase and mutants

經(jīng)上海生工測序，測序結(jié)果與克隆載體測序一致，表明突變的目的基因已插入到pUC18表達載體中，成功構(gòu)建了原核表達載體。

3 結(jié)論

3.1 本研究采用重疊延伸PCR技術(shù)成功地將β－CGTase基因活性中心關(guān)鍵位點的兩個氨基酸Y127，R254分別進行定點突變，得到突變體Y127F和R254F，構(gòu)建出突變重組表達載體，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中誘導(dǎo)表達，使β－CGTase基因?qū)崿F(xiàn)了在大腸桿菌中的有活力表達，為后續(xù)β－環(huán)糊精葡糖糖基轉(zhuǎn)移酶的環(huán)化活性提高提供研究基礎(chǔ)。

3.2 重疊延伸PCR技術(shù)可以將兩個DNA片段連接在一下，使其能夠在體外進行準(zhǔn)確、高效的基因重組，且不需要使用內(nèi)切酶消化和連接酶處理。重疊延伸PCR技術(shù)成功的關(guān)鍵是重疊互補引物的設(shè)計以及模板的純度，重疊互補引物3'端與模板作用，5'端與重疊延伸中待融合的DNA片段互補，引物重疊部分應(yīng)有15～20個堿基，突變的堿基設(shè)計在引物的中間部位。除此之外，還要考慮引物Tm值對PCR結(jié)果的影響，引物的GC含量對Tm值的影響很大，因此引物設(shè)計時盡量降低引物中GC的含量;一個PCR體系中的所有引物的Tm值應(yīng)該相近，以確保延伸擴增的順利進行。模板的純度主要是指第二輪PCR中使用第一輪PCR產(chǎn)物作為模板，因此產(chǎn)物需經(jīng)過純化，通常當(dāng)模板 OD260/OD280 為 1.75～1.80 為最佳。本實驗應(yīng)用Primer premier 5.0軟件設(shè)計突變引物，突變堿基設(shè)計在引物的中間部位，引物重疊部分在15～20個堿基之間，引物GC含量在40%～60%之間，第一輪PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收濃度達到50ng/μL做為第二輪PCR反應(yīng)的模板，經(jīng)延伸PCR擴增產(chǎn)物測序證實在位點Y127，R254成功地進行了基因突變。

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