產(chǎn)溶劑梭菌分子遺傳操作技術(shù)研究進(jìn)展

顧陽，楊晟,2，姜衛(wèi)紅

1中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所，上海 200032

2上海工業(yè)生物技術(shù)研發(fā)中心，上海 201201

產(chǎn)溶劑梭菌 (Solventogenic clostridia)是一類革蘭氏陽性、厭氧細(xì)菌。它們擁有寬泛的底物譜，可將多種碳源轉(zhuǎn)化為丙酮 (Acetone)、丁醇(Butanol)、乙醇 (Ethanol)等各類化學(xué)品，因此也是一類重要的工業(yè)微生物[1]。根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，丙酮丁醇梭菌Clostridium.acetobutylicum和拜氏梭菌Clostridium.beijerinckii是最受研究者關(guān)注的兩種產(chǎn)溶劑梭菌[2]。前者具有較強(qiáng)的淀粉酶合成和分泌系統(tǒng)，適合淀粉質(zhì)原料的發(fā)酵，而后者的淀粉酶活力很低，屬于糖-發(fā)酵菌株[3]，它們發(fā)酵底物生成溶劑產(chǎn)品的過程亦被稱為ABE(Acetone，Butanol，Ethanol) 發(fā)酵。

近年來，面對(duì)石化合成路線的激烈競(jìng)爭(zhēng)和產(chǎn)業(yè)技術(shù)革新升級(jí)的需求，開發(fā)新一代產(chǎn)溶劑梭菌

1 產(chǎn)溶劑梭菌基因失活技術(shù)

目前大多數(shù)原核生物體內(nèi)常用的基因失活技術(shù)是基于同源重組原理的基因刪除，但受限于較低的同源重組率，這一類方法應(yīng)用于產(chǎn)溶劑梭菌時(shí)已被證明效果不佳。解決這一問題有以下幾以提升ABE發(fā)酵的經(jīng)濟(jì)性和競(jìng)爭(zhēng)力已成為該研究領(lǐng)域的當(dāng)務(wù)之急。但受限于分子操作技術(shù)，產(chǎn)溶劑梭菌的遺傳改造在過去一段時(shí)期內(nèi)進(jìn)展緩慢。自2001年起，國際上陸續(xù)公布了若干種產(chǎn)溶劑梭菌的全基因組序列[4-7]，使從分子水平深入研究該類微生物成為可能。2007年起，產(chǎn)溶劑梭菌中基于二類內(nèi)含子的基因中斷技術(shù)見之報(bào)道[8-9]，從而首次提供了一種適用于該類菌的高效基因中斷技術(shù)。此后的5年多，國內(nèi)外研究者們對(duì)原有的產(chǎn)溶劑梭菌遺傳操作系統(tǒng)不斷進(jìn)行優(yōu)化，并開發(fā)出一些新的基因刪除、基因表達(dá)技術(shù)和方法?；诖?，文中對(duì)產(chǎn)溶劑梭菌遺傳操作技術(shù)的發(fā)展進(jìn)行了梳理和總結(jié)，重點(diǎn)介紹了近年來國內(nèi)外研究者在該領(lǐng)域的新進(jìn)展。

種可行策略：1)采用不依賴于同源重組的基因失活方法，如基于二類內(nèi)含子的基因中斷技術(shù)等；2)提高同源重組的頻率，如引入歸巢內(nèi)切酶 (Homing endonuclease)Ⅰ-SceⅠ等系統(tǒng)；3)建立高通量的篩選方法以提高對(duì)同源重組事件的篩選效率，如在重組質(zhì)粒上引入合適的負(fù)篩選標(biāo)記。

1.1 基于二類內(nèi)含子的基因中斷

二類內(nèi)含子是一種特殊的自剪接內(nèi)含子。它可以通過自我剪切離開mRNA前體，并與一種輔助蛋白 (Intron-encoded protein，IEP)形成復(fù)合體。在IEP蛋白的協(xié)助下，內(nèi)含子可以識(shí)別和插入到宿主基因組的特定位點(diǎn)，然后完成反轉(zhuǎn)錄及缺口修復(fù)，最終在目標(biāo)基因內(nèi)部形成一段插入的DNA雙鏈。內(nèi)含子RNA識(shí)別特定DNA序列依靠的是RNA上的兩個(gè)外顯子結(jié)合位點(diǎn)EBS1和EBS2以及與EBS1臨近的δ序列，而目標(biāo)DNA序列上與之對(duì)應(yīng)的分別是內(nèi)含子結(jié)合位點(diǎn)IBS1、IBS2以及δ’[10-12]?；诖耍芯空邆冮_發(fā)出了計(jì)算方法，搜尋目標(biāo)基因序列上的可被二類內(nèi)含子識(shí)別的插入位點(diǎn)，并設(shè)計(jì)出相應(yīng)的內(nèi)含子EBS1、EBS2和δ序列[13]。這樣的人工二類內(nèi)含子可以特異性地插入到目標(biāo)位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)基因失活 (圖1)。

目前，基于二類內(nèi)含子的基因失活技術(shù)已被用于多種微生物[13-16]，而來源于乳酸乳球菌的ltrB基因還被Sigma-Alorich公司開發(fā)成TargetronTM試劑盒。2007年，英國諾丁漢大學(xué)和中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所的兩個(gè)研究組均基于上述原理分別建立了適用于丙酮丁醇梭菌的二類內(nèi)含子基因失活方法[8-9]。諾丁漢大學(xué)的研究組隨后還建立了“Clostron”網(wǎng)站 (www.clostron.com)，提供免費(fèi)的內(nèi)含子序列設(shè)計(jì)工具?；谠摷夹g(shù)，研究者們?cè)诋a(chǎn)溶劑梭菌中進(jìn)行基因失活的效率得到了顯著提高。迄今為止，這種方法已被用于完成產(chǎn)溶劑梭菌中大量的基因中斷操作[17-21]，極大地加快了相關(guān)研究進(jìn)度。盡管基于二類內(nèi)含子的基因失活方法效率較高 (2周左右可完成一輪實(shí)驗(yàn))，但也存在一定的局限性和不足，主要包括：1)對(duì)于某一個(gè)目標(biāo)基因，軟件會(huì)提供若干個(gè)可能的插入位點(diǎn)以及對(duì)應(yīng)的內(nèi)含子序列，但這種基于算法得出的結(jié)果不能保證100%的成功率，有時(shí)需要進(jìn)行多個(gè)位點(diǎn)的嘗試；2)對(duì)于某些較短的基因序列，軟件可能無法給出內(nèi)含子的插入位點(diǎn)；3)內(nèi)含子有可能插入到宿主基因組的其他位點(diǎn)，還需進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證；4)不能實(shí)現(xiàn)基因的刪除；5)對(duì)于一些共轉(zhuǎn)錄的基因簇，采用該技術(shù)敲除上游基因可能會(huì)引起極性效應(yīng)，影響下游基因的表達(dá)；6)由于內(nèi)含子是插入到目標(biāo)基因中，并沒有刪除該基因序列。因此對(duì)于某些基因，尤其是編碼酶蛋白的基因，可能無法完全中斷其功能；7)無法實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的精細(xì)操作，如點(diǎn)突變等。

圖1 基于二類內(nèi)含子的基因失活Fig.1 GroupⅡintron-based gene inactivation.

2011年，中國科學(xué)院微生物研究所的科研人員對(duì)該方法進(jìn)行了改良：在內(nèi)含子內(nèi)部引入一段目標(biāo)基因插入位點(diǎn)上游或下游序列的同源臂。當(dāng)內(nèi)含子插入到目標(biāo)基因的內(nèi)部后，可再通過一次同源重組即可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因部分序列的刪除[22]。顯然，這一新版本方法的功能更為全面，且由于實(shí)現(xiàn)了基因序列的部分刪除，使目的基因功能的缺失更具可靠性。

1.2 基于同源重組的基因刪除

盡管產(chǎn)溶劑梭菌的同源重組效率低，但早期的研究者們?nèi)匀辉谶@方面進(jìn)行了嘗試。一種策略是在質(zhì)粒上構(gòu)建一段與目標(biāo)基因內(nèi)部序列相同的同源序列，將質(zhì)粒導(dǎo)入胞內(nèi)后使其發(fā)生同源重組，通過一次單交換將質(zhì)粒整合至目標(biāo)基因內(nèi)部。借助該方法，研究者們已經(jīng)在模式菌——丙酮丁醇梭菌中失活了一些基因：buk和pta[23]、aad[24]、solR[25]、spoIIE[26]、sigF[27]以及sigE和sigG[28]等。但顯然，通過一次單交換的同源重組無法實(shí)現(xiàn)基因的刪除。另一種策略是在質(zhì)粒上構(gòu)建目標(biāo)基因上下游兩段同源臂、通過兩次單交換來刪除基因。但由于產(chǎn)溶劑梭菌的低同源重組率以及缺乏合適的輔助元件 (如反篩選標(biāo)記、溫敏型復(fù)制子等)，該方法的效率極低，在早期的研究報(bào)道中成功刪除的基因僅有spo0A[29]。

在提高產(chǎn)溶劑梭菌的同源重組效率方面，美國特拉華大學(xué)Papoutsakis教授課題組在丙酮丁醇梭菌中引入了來源于枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis的解旋酶 (Derevolase)編碼基因recU，期望促進(jìn)同源重組的發(fā)生幾率。他們通過一次單交換將質(zhì)粒整合至丙酮丁醇梭菌的目標(biāo)基因內(nèi)部，實(shí)現(xiàn)了基因的失活[26-27]。但需指出的是，其研究報(bào)道中并沒有提供數(shù)據(jù)證明RecU的表達(dá)確實(shí)促進(jìn)了丙酮丁醇梭菌同源重組效率的提高。2012年，該課題組又報(bào)道了將大腸桿菌來源的毒性基因mazF作為反篩選因子用于丙酮丁醇梭菌中基因刪除的操作。他們以乳糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子表達(dá)mazF，可在含乳糖和抗生素的固體培養(yǎng)基上直接篩選出目標(biāo)基因被刪除的突變株[30]；同時(shí)，該方法還參考FLP-FRT位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)[31-32]，在質(zhì)粒上下游同源臂內(nèi)的抗性標(biāo)記基因兩側(cè)加上了FRT序列，當(dāng)重組完成后，通過在突變株中表達(dá)FLP重組酶剔除抗性基因，以便該抗性基因可被繼續(xù)用作篩選標(biāo)記。該方法的不足之處在于：1)會(huì)在刪除基因的位置留下一段FRT疤痕(Scar)，并沒有真正實(shí)現(xiàn)基因無痕刪除；2)隨著基因刪除數(shù)量的增加，染色體上的FRT疤痕也會(huì)隨之增多，當(dāng)有FLP重組酶存在時(shí)，有可能引起這些FRT短序列之間的重組，造成非預(yù)期的基因序列缺失。

為了提高梭菌中重組事件的篩選效率，Heap和Cartman等在篩選方法上做了改進(jìn)，引進(jìn)了反篩選因子。他們?cè)?009年和2010年的兩項(xiàng)專利中提出如下幾種改進(jìn)策略：1)利用宿主細(xì)胞中的乳清酸核苷-5-磷酸脫羧酶基因pyrF作為反篩選因子，以尿嘧啶 (Uracil)和 5-氟乳清酸(5-FOA)兩種成分作為篩選壓力，可有效提高對(duì)同源重組的篩選效率，該方法適用于產(chǎn)溶劑梭菌[33]；2)在質(zhì)粒攜帶的目標(biāo)基因上下游同源臂之間加入不含啟動(dòng)子的抗性基因，當(dāng)質(zhì)粒處于游離狀態(tài)時(shí)，抗性基因不發(fā)揮作用；而當(dāng)發(fā)生同源重組，抗性基因被整合到染色體上，此時(shí)抗性基因借助靶基因的啟動(dòng)子進(jìn)行表達(dá)，使得重組菌表現(xiàn)出抗性，便于篩選[33]；3)將來自E.coli的編碼胞嘧啶脫氨酶的codA基因引入梭菌中作為反篩選因子(圖 2)。該基因可將 5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine)催化為有毒的 5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)。因此，利用5-氟胞嘧啶作為篩選壓力即可幫助鑒定重組子[34]。

圖2 codA作為反篩因子用于鑒定重組子 (H1、H1’和H2、H2’：上下游同源臂)Fig.2 Identification of recombinants using codA as a counter marker.H1,H1’and H2,H2’:homologous arms.

此外，歸巢內(nèi)切酶 (Homing endonuclease)Ⅰ-SceⅠ系統(tǒng)也是提高同源重組率的有效手段。Ⅰ-SceⅠ是釀酒酵母線粒體基因中內(nèi)含子編碼的一種限制性內(nèi)切酶，它能識(shí)別并切割特定的18個(gè)堿基非對(duì)稱序列，產(chǎn)生一個(gè)雙鏈缺口，在有等位基因存在的條件下誘發(fā)同源重組的修復(fù)機(jī)制，進(jìn)而提高同源重組效率。該系統(tǒng)的主要優(yōu)點(diǎn)是適用范圍廣，在革蘭氏陽性和陰性菌中均可使用，對(duì)宿主的選擇無特別要求。自1999年該方法首次在大腸桿菌中使用之后[35]，已被成功應(yīng)用在其他原核生物中[36-38]。作者所在課題組前期亦在丙酮丁醇梭菌中嘗試了該方法，已成功刪除了若干基因 (未發(fā)表數(shù)據(jù))，證明了該方法在梭菌基因刪除中的可行性 (圖3)。

1.3 轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因組隨機(jī)突變

圖3 Ⅰ-SceⅠ介導(dǎo)的基因刪除Fig.3 Ⅰ-SceⅠ-based gene deletion.

轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變是反向代謝工程研究中的重要技術(shù)手段之一。即利用轉(zhuǎn)座子對(duì)基因組進(jìn)行高覆蓋率的隨機(jī)敲除，獲得一個(gè)容量大且隨機(jī)性好的突變株庫。這樣的突變庫可以用于大尺度范圍內(nèi)的目標(biāo)菌株篩選，并且便于后續(xù)對(duì)功能基因的定位。

對(duì)于梭菌屬而言，前期的轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變技術(shù)研究主要針對(duì)的是致病菌—產(chǎn)氣莢膜梭菌C.perfringens和艱難梭菌C.difficile。研究者在C.perfringens中建立了Mu和EZ-Tn5介導(dǎo)的隨機(jī)突變系統(tǒng)[39-40]，這兩種方法均是在體外將轉(zhuǎn)座子DNA和轉(zhuǎn)座酶形成轉(zhuǎn)座復(fù)合體 (Transposome)，然后將該復(fù)合體轉(zhuǎn)化至宿主菌內(nèi)實(shí)施對(duì)基因組的隨機(jī)突變。在C.difficile中，先期建立的則是Tn916和Tn5397轉(zhuǎn)座子突變系統(tǒng)[41-42]。但上述幾種方法均存在轉(zhuǎn)座子插入時(shí)的熱點(diǎn)選擇問題，例如，Mu和EZ-Tn5系統(tǒng)中轉(zhuǎn)座子插入時(shí)對(duì)編碼rRNA的基因具有偏好性[39-40]，隨機(jī)性不佳；Tn916和Tn5397系統(tǒng)也被發(fā)現(xiàn)存在熱點(diǎn)插入和多拷貝插入的問題[43-44]。

早期也有研究者嘗試將來源于鏈球菌的Tn925、Tn1545轉(zhuǎn)座子以及腸球菌的Tn926轉(zhuǎn)座子應(yīng)用于產(chǎn)溶劑梭菌[45-46]。研究結(jié)果表明這些轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)確實(shí)可以在產(chǎn)溶劑梭菌基因組上實(shí)現(xiàn)插入失活，但均存在熱點(diǎn)插入和多拷貝插入的問題，隨機(jī)性不佳，不適合建立高質(zhì)量的單基因隨機(jī)突變體庫。

近年來，mariner轉(zhuǎn)座子受到研究者們的關(guān)注，并在微生物中得到廣泛應(yīng)用[47]。mariner轉(zhuǎn)座子屬于DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座元件，遵循“剪切-粘貼”的轉(zhuǎn)座機(jī)制，轉(zhuǎn)座作用只與轉(zhuǎn)座酶有關(guān)，而與宿主因素?zé)o關(guān)[47]。國外研究者于2010年和2013年先后在致病型艱難梭菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌中建立了mariner轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的隨機(jī)突變方法[48-49]，轉(zhuǎn)座子對(duì)基因組的插入顯示出很好的隨機(jī)性。由于mariner轉(zhuǎn)座子識(shí)別的插入位點(diǎn)是TA堿基，且出現(xiàn)1個(gè)以上拷貝插入的幾率極低，因此理論上非常適合用于在低GC含量的產(chǎn)溶劑梭菌中建立單基因突變體庫。作者所在課題組前期亦嘗試在丙酮丁醇梭菌中建立mariner轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的突變方法，初步結(jié)果表明轉(zhuǎn)座子在基因組上的插入具有很好的隨機(jī)性 (未發(fā)表數(shù)據(jù))，適合建立高質(zhì)量的隨機(jī)突變庫。

2 產(chǎn)溶劑梭菌基因表達(dá)技術(shù)

基因過量表達(dá)是微生物代謝工程中重要的技術(shù)手段之一。1990年和1993年，Williams和Mermelstein等分別建立了拜氏梭菌的接合轉(zhuǎn)移方法和丙酮丁醇梭菌的電轉(zhuǎn)化方法[50-51]。自此，外源質(zhì)粒DNA可以被高效地導(dǎo)入這兩種主要的產(chǎn)溶劑梭菌中，以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的過量表達(dá)。

2.1 依賴于質(zhì)粒系統(tǒng)的基因表達(dá)

2.1.1 載體及復(fù)制子

以質(zhì)粒為載體攜帶基因?qū)崿F(xiàn)過量表達(dá)的方法簡(jiǎn)單有效，在微生物代謝工程中被普遍采用。產(chǎn)溶劑梭菌主要使用穿梭型質(zhì)粒，即同時(shí)含有E.coli和梭菌的復(fù)制子，以便于遺傳轉(zhuǎn)化。穿梭質(zhì)粒中常用的E.coli復(fù)制子有高拷貝數(shù)的ColE1和低拷貝數(shù)的p15a；而產(chǎn)溶劑梭菌使用的復(fù)制子則有較多選擇，例如，Williams等構(gòu)建了同時(shí)包含來源于IncP型質(zhì)粒RK2的oriT元件以及復(fù)制子 pAMβ1(Enterococcus faecalis)、 pCB101(Clostridium butyricum)、pWV01(Streptococcus cremoris)三者中之一的穿梭載體 (表1)，實(shí)現(xiàn)了載體從E.coli向拜氏梭菌C.beijerinckiiNCIMB 8052中的轉(zhuǎn)移；而對(duì)于丙酮丁醇梭菌，復(fù)制子的來源更為廣泛，在表1中亦列出了迄今報(bào)道的可用于丙酮丁醇梭菌的復(fù)制子。當(dāng)然，不同復(fù)制子的轉(zhuǎn)化率和穩(wěn)定性差別較大。例如，Heap等將包含 pBP1、pCB102、pCD6、pIM13復(fù)制子的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化丙酮丁醇梭菌，轉(zhuǎn)化率分別為 1.38×102、2.45×102、8.47×101、2.92×102，質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中的分裂穩(wěn)定性 (Segregational stability)則分別為99.4%、76.5%、82.4%和81.6%[52]。

2.1.2 啟動(dòng)子

啟動(dòng)子是基因表達(dá)及調(diào)控的重要順式元件，其強(qiáng)度的高低直接影響著基因的表達(dá)水平。根據(jù)啟動(dòng)基因表達(dá)方式的不同，啟動(dòng)子一般可以分為組成型啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，它們通過不同的方式在基因表達(dá)中發(fā)揮作用。

組成型啟動(dòng)子的強(qiáng)度由自身的序列特征決定，啟動(dòng)子的?10區(qū)和?35區(qū)兩個(gè)保守區(qū)域上下游、間區(qū)的序列和長(zhǎng)度的變化都影響著啟動(dòng)子的效率[58]。表2列舉了丙酮丁醇梭菌中已被鑒定的一些啟動(dòng)子。但根據(jù)已有報(bào)道，其中比較常見的用于基因過量表達(dá)的啟動(dòng)子為Pptb、Padc和Pthl[18-19,59-62]。

表1 已報(bào)道的產(chǎn)溶劑梭菌復(fù)制子Table 1 Reported repliconsofsolventogenic clostridia

表2 已報(bào)道的丙酮丁醇梭菌啟動(dòng)子Table 2 Reported available promotersof C.acetobutylicum

Padc adc[64]PgroESL groESL[65]Pptb ptb-buk[66]Psol adhE-ctfA-ctfB[67]Pthl thl[68]PhydA hydA[69]Ppta pta-ack[70]PabrB310 abrB310[71]PsinR sinR[71]

誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在微生物代謝工程和代謝調(diào)控研究中具有重要價(jià)值。但根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，已發(fā)現(xiàn)和鑒定的可用于產(chǎn)溶劑梭菌的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子較少。2003年，Girbal等以Staphylococcus xylosus中木糖操縱子為基礎(chǔ)在丙酮丁醇梭菌中建立了受木糖誘導(dǎo)的基因表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)在以木糖為唯一碳源的條件下，gusA報(bào)告基因的表達(dá)量顯著提高[72]；2012年，董紅軍等在丙酮丁醇梭菌建立了四環(huán)素誘導(dǎo)的基因表達(dá)系統(tǒng)。該系統(tǒng)在不添加四環(huán)素的條件下，TetR蛋白結(jié)合含有tetO序列的啟動(dòng)子，抑制下游基因的表達(dá)，當(dāng)添加四環(huán)素后，TetR與四環(huán)素結(jié)合，使含有tetO序列的啟動(dòng)子強(qiáng)度提高了40倍[73]；2012年，Mohab等以C.perfringens來源的乳糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Pbgal驅(qū)動(dòng)毒性基因mazF作為反向篩選標(biāo)記，用于建立丙酮丁醇梭菌中基于同源重組的基因刪除和敲入系統(tǒng)[30]。

2.2 整合至染色體的基因表達(dá)技術(shù)

依賴于復(fù)制型質(zhì)粒的基因表達(dá)在穩(wěn)定性上存在先天不足，因而在實(shí)際應(yīng)用中受到限制。將外源基因片段通過同源重組整合至宿主菌的染色體上是實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)的必要手段，但受限于產(chǎn)溶劑梭菌極低的同源重組效率，這一策略在該類微生物中長(zhǎng)期未得以實(shí)現(xiàn)。

2012年，英國諾丁漢大學(xué)的Heap等在丙酮丁醇梭菌中建立了高效的基因整合至染色體的ACE(Allele-coupled exchange)技術(shù)方法[74]。他們利用丙酮丁醇梭菌的pyrE(編碼乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶)基因座通過兩次雙交換實(shí)現(xiàn)了外源基因在該位置的插入；在此基礎(chǔ)上，借助染色體上thl(編碼硫解酶)基因的啟動(dòng)子，并以pyrE和ermB基因 (紅霉素抗性基因)作為選擇標(biāo)記輪替使用，實(shí)現(xiàn)了外源基因在thl基因座的連續(xù)插入，最終他們將λ噬菌體46.5 kb的基因組DNA整合到丙酮丁醇梭菌的染色體上。

此外，如上所述，美國特拉華大學(xué)的AI-Hinai等在丙酮丁醇梭菌中建立的基于MazF的基因刪除技術(shù)亦可實(shí)現(xiàn)外源基因在染色體上的敲入。利用該方法，他們將來源于Clostridium ljungdahlii的甲酸脫氫酶基因fdh整合至丙酮丁醇梭菌的染色體上[30]。

上述兩項(xiàng)研究在產(chǎn)溶劑梭菌中實(shí)現(xiàn)了比較高效的染色體基因敲入，保證了目的基因過量表達(dá)時(shí)的穩(wěn)定性，這對(duì)于該類工業(yè)微生物的遺傳改造至關(guān)重要。尤其是ACE方法可實(shí)現(xiàn)數(shù)十kb的大片段基因在染色體上的整合，為今后產(chǎn)溶劑梭菌的合成生物學(xué)研究提供了有效的遺傳操作工具。

3 總結(jié)與展望

產(chǎn)溶劑梭菌的研究長(zhǎng)期受限于其不完善的分子操作工具。近年來，這方面的研究取得了較大進(jìn)展，開發(fā)出了一系列用于基因中斷和刪除、基因表達(dá)、基因整合的新方法和新工具。利用這些方法和工具，目前研究者們已經(jīng)可以較方便地對(duì)這類厭氧微生物進(jìn)行分子水平的改造以及遺傳學(xué)方面的基礎(chǔ)性研究。但需要指出的是，相比于一些遺傳操作手段多樣且高效的模式微生物(如大腸桿菌、枯草芽胞桿菌等)而言，產(chǎn)溶劑梭菌在這方面還有極大的提升空間。僅就基因無痕刪除而言，產(chǎn)溶劑梭菌極低的同源重組率目前仍然是實(shí)際操作中的不利因素，使得相關(guān)的實(shí)驗(yàn)過程費(fèi)時(shí)費(fèi)力。此外，隨著近年來“合成生物學(xué)”的逐步興起，人們也認(rèn)識(shí)到全面高效的遺傳操作工具和豐富多樣的分子元件是有效開展合成生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，因此，產(chǎn)溶劑梭菌的研究在工具和元件開發(fā)方面也面臨著新的機(jī)遇和挑戰(zhàn)。

基于以上分析，產(chǎn)溶劑梭菌遺傳操作技術(shù)仍需在以下幾方面進(jìn)行升級(jí)和拓展：1)進(jìn)一步優(yōu)化現(xiàn)有基于同源重組的基因刪除方法?？梢M(jìn)其他微生物中一些比較成熟的技術(shù)平臺(tái)，在產(chǎn)溶劑梭菌中進(jìn)行整合和改良，提高同源重組效率。例如，可挖掘噬菌體重組元件[75]，構(gòu)建梭菌版的PCR-targeting系統(tǒng)；以及發(fā)掘適用于產(chǎn)溶劑梭菌的條件型復(fù)制元件 (如溫敏型復(fù)制子等)用于目前仍依賴于復(fù)制型質(zhì)粒的同源重組操作，減少篩選第一步單交換事件的工作量；2)發(fā)展更為高效的外源基因在染色體上的整合技術(shù)，用于基因表達(dá)。本文前述的ACE方法雖然已經(jīng)實(shí)現(xiàn)大片斷基因在丙酮丁醇梭菌染色體上的整合及表達(dá)，但篩選工作量較大，周期較長(zhǎng)，因此在效率方面仍有較大提升空間；3)開發(fā)功能更為強(qiáng)大的分子操作工具，如類似CRISPER-Cas的多位點(diǎn)共編輯系統(tǒng)[76]，以及類似CiCHE和Mu噬菌體mini-Mu介導(dǎo)的多拷貝定點(diǎn)和隨機(jī)整合技術(shù)等[77-78]；4)設(shè)計(jì)和合成適用于產(chǎn)溶劑梭菌的各類生物元件、基因開關(guān)和功能模塊，實(shí)現(xiàn)在這類重要工業(yè)微生物中開展更為精細(xì)的分子遺傳操作，從而為開展合成生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

致謝：中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所楊蘊(yùn)劉研究員對(duì)綜述的撰寫提出了許多寶貴的建議，在此表示感謝。

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