SELDI蛋白質(zhì)指紋對(duì)因基因多態(tài)性導(dǎo)致耐藥性漂移診斷的前瞻性研究
——吉非替尼與含鉑方案序貫治療非小細(xì)胞肺癌

吉利娜 裴毅

惡性腫瘤抗腫瘤治療失敗多因耐藥所致，包括原發(fā)性耐藥和繼發(fā)性耐藥兩種，多表現(xiàn)為一種多藥耐藥的特點(diǎn)。耐藥的出現(xiàn)必須換藥治療已成共識(shí)，但是再換的藥又發(fā)生耐藥該如何處理呢？對(duì)此，我們課題小組采用2008年發(fā)現(xiàn)的SELDI蛋白質(zhì)組指紋可以篩選出吉非替尼治療非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的優(yōu)勢(shì)人群和耐藥發(fā)生這一研究結(jié)果[1]，設(shè)計(jì)對(duì)含鉑方案化療失敗后選擇吉非替尼（gefitinib）治療的患者根據(jù)SELDI蛋白質(zhì)指紋M/Z: 8,693±50H+的豐度為選擇含鉑方案化療和繼續(xù)服用吉非替尼治療的依據(jù)，有計(jì)劃地進(jìn)行化療和吉非替尼的序貫治療，現(xiàn)將觀察結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 病例資料 本組9例患者為2006年12月-2009年10月我科收治的病理診斷明確的NSCLC，男性1例，女性8例。年齡37歲-76歲，中位年齡56歲。病理學(xué)類型：腺癌8例（均為女性），肺泡細(xì)胞癌1例（為男性），入組患者在服用吉非替尼前均接受過(guò)至少2個(gè)周期以上的TP（紫杉醇+順鉑）、DP（多西他賽+順鉑）或GP（吉西他濱+順鉑）方案化療，影像學(xué)檢查提示腫瘤增大或有轉(zhuǎn)移，根據(jù)指紋M/Z：8,693±50H+豐度≤15%，服用吉非替尼治療，動(dòng)態(tài)觀察其指紋豐度，＞25%停用吉非替尼治療并至少接受1次以上TP、DP或GP方案化療后，兩者之間根據(jù)腫塊變化和腫瘤標(biāo)記物變化決定取舍吉非替尼治療時(shí)間，又接受吉非替尼治療并有效或穩(wěn)定者，完成序貫周期交替達(dá)1次以上直至死亡。其中肺內(nèi)轉(zhuǎn)移1例，骨轉(zhuǎn)移2例，肝轉(zhuǎn)移2例，腦轉(zhuǎn)移1例。

1.2 實(shí)驗(yàn)工作

1.2.1 主要儀器、軟件及試劑 PBS-IIc表面增強(qiáng)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（SELDI-TOF-MS）、能量吸收分子EMA、CM10型蛋白質(zhì)芯片及相應(yīng)分析軟件，HFPFS緩沖鹽（Sigma公司），CHAPS緩沖鹽（Sigma公司）。

1.2.2 標(biāo)本采集及處理 首次治療前取清晨空腹末梢靜脈血3 mL，靜置，3,000 r/min離心5 min分離血清，-80oC冰箱保存。血清標(biāo)本冰浴解凍，10,000 r/min離心2 min。取5 μL樣品，加10 μL 9 M尿素。振蕩30 min，加180 μL緩沖液稀釋（100 mmol/L NaOAc pH 4.0），4oC 10,000 r/min離心2 min，取上清待用。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)方法 ①芯片預(yù)處理：將芯片安裝到Bioprocessor上，每孔加200 μL結(jié)合緩沖液（100 mmol/L NaOAc pH4.0），振蕩5 min，拍干，重復(fù)1次。每孔上樣100 μL血清樣品，室溫振蕩1 h。甩去液體，用200 μL結(jié)合緩沖液洗2次，每次5 min，拆下芯片，待芯片自然干燥，然后每點(diǎn)加SPA（乙腈50%和三氟乙酸0.5%的飽和溶液）0.5 μL兩次，干燥待測(cè)。②數(shù)據(jù)收集：用加有Allin-one標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的NP20芯片校正質(zhì)譜儀，設(shè)定儀器參數(shù)，在Ciphergen ProteinChip軟件中設(shè)定讀片程序讀取芯片數(shù)據(jù)，其中橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)質(zhì)荷比（M/Z），縱坐標(biāo)為蛋白質(zhì)相對(duì)含量（豐度）。

1.3 序貫治療方法

1.3.1 化療方案 選擇TP（紫杉醇+順鉑）、DP（多西他賽+順鉑）或GP（吉西他濱+順鉑）方案。

1.3.2 序貫治療路徑 經(jīng)TP、DP和GP方案化療失敗的患者，通過(guò)SELDI檢測(cè)，若M/Z（質(zhì)核比）8,693±50H+的豐度≤15%，接受口服吉非替尼250 mg，1次/d，治療期間每2個(gè)月查患者血清SELDI指紋，以M/Z: 8,693±50H+的豐度＞25%作為再選擇含鉑方案化療指標(biāo)，并以M/Z: 8,693±50H+豐度≤15%為繼續(xù)服用吉非替尼的指標(biāo)，兩者之間根據(jù)腫塊變化和腫瘤標(biāo)記物變化決定取舍吉非替尼治療時(shí)間，指導(dǎo)吉非替尼與含鉑方案的序貫治療（圖1）。

圖1 吉非替尼與含鉑方案序貫治療非小細(xì)胞肺癌治療路徑Fig1 The sequential therapy of non-small cell lung cancer(NSCLC) with platinum-based regime and Gefitinib

1.4 療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 腫瘤病灶療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)采用WHO實(shí)體腫瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[2]，包括完全緩解（complete response, CR）、部分緩解（partial response, PR）、疾病穩(wěn)定（stable disease, SD）和疾病進(jìn)展（progresive disease,PD）。

1.5 研究觀察標(biāo)準(zhǔn) 對(duì)所有患者每2個(gè)月隨訪一次，直至死亡，觀察總生存期。

2 結(jié)果

隨訪至2010年12月（最后一個(gè)患者去世），9例患者中位總生存期為27個(gè)月（10個(gè)月-66個(gè)月）。9例患者中，有4例規(guī)律行化療及吉非替尼序貫治療，2例患者服吉非替尼期間出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，行化療，療效SD后繼續(xù)口服吉非替尼，另3例患者因?yàn)榛煾弊饔没蚪?jīng)濟(jì)原因未嚴(yán)格完成序貫周期。

3 討論

含鉑方案化療是目前治療NSCLC的主要化療方法，一旦出現(xiàn)耐藥，再選擇治療是很困難的，靶向藥物酪氨酸激酶受體抑制劑（tyrosine kinase inhibitor, TKI）吉非替尼的出現(xiàn)，無(wú)疑為這些患者帶來(lái)希望，一系列的臨床研究都在探索吉非替尼一線治療NSCLC的多種模式及其可能性，然而研究[3,4]表明吉非替尼與含鉑方案同步聯(lián)合一線治療晚期NSCLC，與單純一線化療相比未能顯示出生存優(yōu)勢(shì)，可能解釋為T(mén)KI與細(xì)胞毒化療藥物之間有潛在的拮抗作用。為克服TKI與化療同步聯(lián)合所帶來(lái)的拮抗效應(yīng)，專家們?cè)O(shè)計(jì)靶向藥物與化療藥物的序貫聯(lián)合，以表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）表達(dá)作選擇靶向藥物的取舍標(biāo)記，也未得出有意義的結(jié)論[5]。在BR.21和ISEL兩大多中心隨機(jī)臨床試驗(yàn)中[6-8]，也發(fā)現(xiàn)吉非替尼單藥用于晚期耐藥性NSCLC并不能明顯改善生存期。這是由于約80%的肺癌患者服用EGFR-TKI11個(gè)月左右出現(xiàn)耐藥復(fù)發(fā)，喪失對(duì)其原有的敏感性[9-11]，其依然存在有耐藥問(wèn)題，因此化療與EGFR-TKI聯(lián)合應(yīng)用有望加強(qiáng)NSCLC的治療效果。

現(xiàn)有的理論認(rèn)為腫瘤是個(gè)異質(zhì)體，這與腫瘤基因的多態(tài)性有關(guān)[12-13]，目前針對(duì)EGFR的基因分層也發(fā)現(xiàn)同種NSCLC瘤體內(nèi)EGFR分布有差異，這些差異均表明對(duì)吉非替尼治療的敏感性不同[14]。因此面對(duì)含鉑方案化療耐藥并吉非替尼再治療失敗的患者，我們?cè)O(shè)想其原因是否與腫瘤異質(zhì)體有關(guān)，形成一種特殊的無(wú)效治療現(xiàn)象：即敏感腫瘤被殺滅后不敏感腫瘤生長(zhǎng)加速，導(dǎo)致某種治療失敗，形成一種治療不敏感性交替發(fā)生的現(xiàn)象，們稱之為腫瘤耐藥性的漂移，這實(shí)際上是腫瘤基因多態(tài)性的一個(gè)表達(dá)結(jié)果，因此希望借助于有計(jì)劃地選擇這些曾經(jīng)敏感的藥物交替序貫應(yīng)用治療NSCLC以解決這一問(wèn)題。

我們的前期研究完成了采用SELDI技術(shù)預(yù)測(cè)吉非替尼治療NSCLC的療效，以決定吉非替尼治療NSCLC的取舍，在長(zhǎng)達(dá)3年的研究中我們認(rèn)為采用SELDI技術(shù)不僅可以發(fā)現(xiàn)吉非替尼治療NSCLC的原發(fā)性耐藥，也能發(fā)現(xiàn)繼發(fā)性耐藥。其蛋白質(zhì)指紋圖譜M/Z：8,693±50H+ 豐度≤25%，可以作為吉非替尼治療NSCLC患者取舍的篩選指標(biāo)[15,16]，因此，治療期間M/Z：8,693±50H+指紋豐度由小于25%發(fā)展至大于25%可認(rèn)為是獲得性耐藥的標(biāo)記指紋。很顯然，腫瘤耐藥性的漂移現(xiàn)象能被SELDI技術(shù)發(fā)現(xiàn)。因此根據(jù)SELDI指紋的不同標(biāo)記有計(jì)劃地應(yīng)用含鉑化療方案和吉非替尼序貫治療NSCLC，以解決含鉑方案化療失敗后應(yīng)用吉非替尼治療失敗后的再治療問(wèn)題。

在本研究的9例患者中，中位總生存期為27個(gè)月（10個(gè)月-66個(gè)月），有4例規(guī)律行化療及吉非替尼序貫治療，2例患者服吉非替尼期間出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，行化療，療效SD后繼續(xù)口服吉非替尼。

另有3例患者，其中1例在服吉非替尼期間由于口鼻和顏面嚴(yán)重皮疹且在服藥時(shí)發(fā)作而不得不停用吉非替尼，其蛋白質(zhì)指紋檢查M/Z: 8,693±50H+豐度＜10%?；熜Ч?，化療后4個(gè)月死亡，總生存期為21個(gè)月；1例患者在服用吉非替尼7個(gè)月后因腫瘤增大行指紋檢查發(fā)現(xiàn)耐藥，化療3周期，療效PD，后由于輕微副反應(yīng)及經(jīng)濟(jì)問(wèn)題放棄治療，總生存期達(dá)23個(gè)月；另1例口服吉非替尼后由于耐藥間斷化療2年，化療期間未規(guī)律行SELDI檢查，因腫瘤增大死亡，總生存期達(dá)25個(gè)月。

從以上結(jié)果可以看出，除2例不能入組外，其余都進(jìn)行了兩個(gè)循環(huán)周期的治療，顯然，吉非替尼對(duì)NSCLC的治療發(fā)生耐藥性的漂移是存在的，但從結(jié)果中又看到，生存期低于30個(gè)月的患者幾乎都死于腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，顯然針對(duì)吉非替尼耐藥漂移的治療，僅選擇與含鉑方案的序貫化療是不足的，應(yīng)根據(jù)腫塊變化和腫瘤標(biāo)記物的變化給予同步治療是非常有必要的。

我們認(rèn)為：根據(jù)研究的結(jié)果，由于基因多態(tài)性導(dǎo)致有一部分患者出現(xiàn)耐藥性的漂移，使常規(guī)治療失敗，同時(shí)，這種針對(duì)NSCLC患者抗腫瘤藥物耐藥的漂移現(xiàn)象表明含鉑方案和吉非替尼之間存在有抗NSCLC作用的互補(bǔ)性，其互補(bǔ)性的基礎(chǔ)是如何能發(fā)現(xiàn)并預(yù)測(cè)優(yōu)勢(shì)腫瘤和劣勢(shì)腫瘤。SELDI技術(shù)可以通過(guò)指紋標(biāo)記發(fā)現(xiàn)并預(yù)測(cè)這些現(xiàn)象，以此做出診斷，以SELDI標(biāo)記指紋作為含鉑方案化療和吉非替尼治療NSCLC的取舍標(biāo)記，有可能提高NSCLC患者藥物治療的獲益率和獲益時(shí)間，以此延長(zhǎng)生存期。這種序貫治療選擇的取舍是在借助于SELDI指紋對(duì)某種藥物治療療效預(yù)測(cè)的平臺(tái)上完成的，是以預(yù)測(cè)結(jié)果作為應(yīng)用藥物治療取、舍的標(biāo)記，更能體現(xiàn)早診、早治的腫瘤治療理念，因此，根據(jù)前瞻性研究的結(jié)論，有必要擴(kuò)大研究范圍進(jìn)行深入研究。

表 1 9例晚期NSCLC患者治療情況Tab 1 The treatment records of nine patients with non-small cell lung cancer