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    巴氏醋酸桿菌滬釀1.0 1乙醇氧化產(chǎn)醋酸關(guān)鍵酶的研究

    2013-09-03 10:15:56朱小明夏小樂楊海麟
    食品工業(yè)科技 2013年2期
    關(guān)鍵詞:產(chǎn)酸脫氫酶菌體

    朱小明,夏小樂,楊海麟,王 武

    (江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室,江蘇無錫214036)

    醋酸菌是嚴格好氧菌,屬于變形菌綱,有超過10個屬的一類微生物[1],它們是重要的工業(yè)微生物,廣泛用于食醋生產(chǎn)。目前應(yīng)用于工業(yè)的食醋生產(chǎn)主要是醋酸菌中的醋酸桿菌屬和葡糖桿菌屬[2],二者均能將乙醇氧化生成醋酸。我國食醋釀造所用的醋酸菌主要是AS1.41和滬釀1.01,二者都屬于醋酸桿菌屬中的巴氏醋桿菌,前者酒精生成醋酸的轉(zhuǎn)化率較高,但有過氧化作用,能進一步將醋酸氧化生成二氧化碳和水,后者的過氧化作用較弱[3-4]。食醋生產(chǎn)中醋酸發(fā)酵過程主要涉及到兩種酶:乙醇脫氫酶(ADH)[5]和乙醛脫氫酶(ALDH)[6],均結(jié)合于細胞膜上,位于細胞膜外側(cè),以PQQ[7-8]為輔酶的膜結(jié)合脫氫酶。在胞內(nèi)同時存在著以NAD為輔酶的ADH和ALDH,但它們對乙醇的氧化只通過TCA途徑和乙醛酸途徑,并不參與乙醇氧化產(chǎn)醋酸[9]。底物乙醇在膜結(jié)合乙醇脫氫酶(ADH)的催化下生成乙醛,中間產(chǎn)物乙醛接著在膜結(jié)合乙醛脫氫酶(ALDH)的作用下生產(chǎn)醋酸[10]。越來越多的研究表明,醋酸發(fā)酵是依賴于細胞膜結(jié)合的乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶完成的,其酶活水平直接影響著產(chǎn)酸。周秉承[11]的研究表明醋酸菌的產(chǎn)酸速率與菌ADH的活力有著極明顯的相關(guān)性,產(chǎn)酸速率隨著活力的升高而升高,反之亦然;Trcek等[12]比較了葡糖醋桿菌和巴氏醋桿菌發(fā)酵中的PQQ-ADH差異,發(fā)現(xiàn)葡糖醋桿菌能產(chǎn)更高濃度的酸,其PQQ-ADH的表達量也相應(yīng)較多,且PQQ-ADH的特性也表現(xiàn)出差異。醋酸菌作為一類特殊的微生物,在醋酸發(fā)酵過程中既要有一定的乙醇耐受能力,也要有一定的醋酸耐受能力。乙醇氧化生產(chǎn)醋酸的代謝途徑相對簡單,由膜結(jié)合ADH和ALDH組成產(chǎn)醋酸的關(guān)鍵酶系。但在發(fā)酵過程中,這兩者所表現(xiàn)出來的水平也不盡相同,大量的研究已經(jīng)表明PQQ-ADH與產(chǎn)酸存在直接的關(guān)系,但對發(fā)酵過程中酶系的動態(tài)變化及與產(chǎn)酸之間存在的關(guān)系闡述較少。本實驗將探究在發(fā)酵過程中脫氫酶系的變化規(guī)律,并揭示酶系與產(chǎn)酸的規(guī)律,同時探究底物乙醇及底酸乙酸對酶系的影響。通過對酶系酶活的調(diào)控,在酶系水平為提高產(chǎn)酸強度提供可能性,并為生產(chǎn)實踐提供一定的理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    滬釀1.01 本實驗室保藏菌種;葡萄糖、酵母粉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、無水硫酸鎂、鐵氰化鉀、無水乙醇、40%乙醛、Triton X-100、檸檬酸、乙二胺二乙酸二鈉鹽、硫酸鐵、十二烷基硫酸鈉、95%磷酸 均為分析純;液體種子培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖10g,酵母粉10g,pH6.5,滅菌冷卻至60℃以下,再加無水乙醇40mL;發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖10g,酵母粉10g,磷酸二氫鉀0.5g,無水硫酸鎂0.5g,滅菌冷卻至60℃以下,根據(jù)實驗要求添加乙醇及底酸乙酸。

    無菌操作臺、振蕩培養(yǎng)箱 江蘇太倉實驗設(shè)備廠;3K15高速冷凍離心機 德國sigma公司;SONICVC-130型超聲細胞破碎儀 上海史佩林實驗室裝備有限公司;722型分光光度計 上海珂淮儀器有限公司;Bioflo115機械攪拌式發(fā)酵罐 美國NBS公司。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 培養(yǎng)方法 種子活化培養(yǎng)條件:將1mL種子甘油管接種于45mL種子培養(yǎng)基中,30℃,在170r/min下?lián)u床培養(yǎng)20~24h。

    搖瓶發(fā)酵培養(yǎng):將活化的種子液按10%的體積分數(shù)比接種到500mL三角瓶的發(fā)酵培養(yǎng)基中,裝液量90mL,30℃,170r/min搖床培養(yǎng)108h。

    發(fā)酵罐發(fā)酵條件:將活化的種子液按10%的體積分數(shù)比接種到7.5L的發(fā)酵罐中,發(fā)酵培養(yǎng)基為3.5L,攪拌轉(zhuǎn)速400r/min,通氣量為0.2VVM,發(fā)酵溫度30℃。

    1.2.2 分析方法 菌體密度:可見分光光度計于600nm(OD600)處測定吸光度。

    酸度測定:0.1mol/L標準NaOH溶液滴定法,以醋酸計。

    粗酶液的獲得:取相應(yīng)時間的發(fā)酵液(100mL),于4℃,8000×g條件下離心10min,用50mmol/L(pH5.8)的磷酸鹽緩沖液(KPB)洗滌2次,然后重新懸浮于該緩沖液中(0.1g濕菌體/3mL KPB),在冰浴下進行超聲破碎,240W,3s/3s,總時間10min。破碎液作為粗酶液待用。

    ADH、ALDH酶活的測定:參照WOOD氏法[13],取0.5mL Mcllvaine緩沖液(pH4.0),1.0mol/L乙醇(乙醛)溶液0.1mL,粗酶液0.1mL,6%Triton X-100 0.1mL于10mL比色管中,25℃保溫5min后加入0.1mol/L鐵氰化鉀溶液0.2mL,在25℃條件下放置反應(yīng)5min(同時做空白對照),然后加入硫酸鐵-Dupanol溶液0.5mL終止反應(yīng),25℃下放置20min,加入3.5mL蒸餾水混合后,用紫外可見分光光度計測定660nm光密度。在25℃、pH4.0條件下,1min氧化1μmol乙醇的酶量為1個酶活力單位;4.0光密度等于氧化1μmol乙醇。

    酶活性(U/mL)=A660×1/4×1/5×1/酶液(mL)×稀釋倍數(shù)

    比酶活(U/mg)=酶活性(U/mL)/總蛋白(mg/mL)

    2 結(jié)果與討論

    2.1 醋酸分批發(fā)酵實驗

    將活化的種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,定時取樣分析,結(jié)果如圖1所示。醋酸菌產(chǎn)醋酸過程大致分三個階段,即高速積累期(0~42h),平緩增長期(42~60h),同化消耗期(60h~)。在發(fā)酵前期,菌體活力強,產(chǎn)酸較快。隨著菌體生長進入末期,菌體活力下降,此時產(chǎn)酸較慢。進入發(fā)酵末期,底物乙醇基本被消耗殆盡,醋酸菌產(chǎn)生過氧化現(xiàn)象,進入TCA途徑,同化醋酸生成水和二氧化碳[14]。

    圖1 醋酸菌醋酸生成及酒精消耗與發(fā)酵時間的關(guān)系Fig.1 Acetic acid production and ethanol consumption in the fermentation process

    2.2 醋酸發(fā)酵過程中ADH和ALDH酶活的動態(tài)分析

    7L發(fā)酵罐中裝入3.5L發(fā)酵培養(yǎng)基,滅菌后加入5%的乙醇(v/v),按10%的接種量接入種子進行發(fā)酵。定時取樣,按上述方法測定樣品的ADH和ALDH的酶活,結(jié)果見表1。從表1中可以看出,在整個醋酸發(fā)酵過程中,醋酸菌的ADH和ALDH的酶活成動態(tài)變化。發(fā)酵過程中,醋酸菌具有較高的ADH酶活性,并于36h達到酶活峰值,為8.21U/mg;醋酸菌在24~42h間以較高速率積累醋酸,而在42~60h積累速度明顯放緩。醋酸發(fā)酵進入到60h之后,ADH酶活進入低水平階段,醋酸開始出現(xiàn)同化現(xiàn)象。與ADH相似,ALDH在24~48h間酶活處于高水平,同樣在36h到達酶活峰值。但相對于ADH,ALDH在整個發(fā)酵過程中酶活水平始終較低。ADH、ALDH作為乙醇氧化代謝生成醋酸途徑中的兩個關(guān)鍵酶,其酶活水平與產(chǎn)酸速率之間可能會存在著對應(yīng)關(guān)系。表1同時反映了在發(fā)酵過程中比產(chǎn)酸速率與酶系水平的關(guān)系:在酶活水平較高時,比產(chǎn)酸速率也較快。在發(fā)酵初始階段,菌體在適應(yīng)新的環(huán)境,菌體生長處于延滯期,此時ADH和ALDH的酶活很低,可能此時酶系還未進行大量誘導(dǎo)表達,此時產(chǎn)酸速率和比生長速率接近于零。隨著菌體生長進入對數(shù)生長,比生長速率處于較高的水平,此時酶活水平顯著提高,產(chǎn)酸速率也同步加快,發(fā)酵液中開始積累大量的醋酸;隨著發(fā)酵進入穩(wěn)定期及后期,比生長速率不斷下降,酶活水平也呈急劇下降趨勢,ADH由最高的8.21U/mg下降到了接近于零,在這一時期,產(chǎn)酸速率一直下降至趨于零。

    表1 醋酸發(fā)酵過程中關(guān)鍵酶系酶活力和比產(chǎn)酸速率Table 1 The specific activities of the key ezymes and specifice acetic acid production rate in the fermentation process

    2.3 底物乙醇濃度對乙醇脫氫酶(ADH)和乙醛脫氫酶(ALDH)表達的影響

    在500mL三角瓶中裝入90mL發(fā)酵培養(yǎng)基,滅菌后分別加入0、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%不同濃度的乙醇,按10%的接種量接入種子。分別培養(yǎng)到菌體對數(shù)生長后期,將發(fā)酵液于4℃,8000×g條件下離心,按上述方法進行超聲破碎并進行ADH和ALDH酶活測定,結(jié)果見表2。

    圖2 不同底物乙醇濃度下發(fā)酵乙醇脫氫酶(ADH)和乙醛脫氫酶(ALDH)的酶活變化特征Fig.2 Enzyme activities of ADH and ALDH in different ethanol concentration

    從圖2可以看出,在不同底物乙醇濃度下,醋酸菌的ADH和ALDH的活性水平發(fā)生改變。在沒有乙醇的發(fā)酵條件下,ADH和ALDH的酶活水平很低,分別為0.38U/mg和0.28U/mg。在乙醇濃度1%~3%(v/v)間,隨著培養(yǎng)基中乙醇濃度的升高,ADH和ALDH的酶活水平也提高,并在3%乙醇濃度時,ADH和ALDH的活性水平達到最高,分別為3.79U/mg和2.36U/mg。隨著乙醇濃度的再升高,ADH和ALDH的活性又開始下降;當乙醇濃度到達7%時,ADH和ALDH的酶活水平降到了很低的水平。這與發(fā)酵過程中的菌體的生長表現(xiàn)是一致的,在乙醇濃度較低時,菌體生長活躍,產(chǎn)酸較快。隨著濃度的升高,菌體生長受到抑制,產(chǎn)酸速率也相對較慢。同時,由圖2可以看出,乙醇的存在對ADH和ALDH基因的表達存在誘導(dǎo)作用,但這種誘導(dǎo)是在一定的濃度范圍內(nèi),如超過這個濃度范圍,反而又不利于ADH和ALDH基因的表達。因此,在實際生產(chǎn)液醋過程中,可以通過控制發(fā)酵醪中乙醇的濃度在ADH和ALDH酶活水平較高的范圍內(nèi),從而提高生產(chǎn)強度,達到從酶學(xué)水平調(diào)控發(fā)酵的目的。單純從乙醇濃度對ADH和ALDH酶活的影響,可以選擇3%乙醇濃度作為發(fā)酵培養(yǎng)基的初始乙醇濃度,對于半連續(xù)發(fā)酵,控制乙醇濃度為3%(v/v)能夠使雙酶的活性維持在一個較高的水平,對于生產(chǎn)具有實際意義。

    2.4 底酸對乙醇脫氫酶(ADH)和乙醛脫氫酶(ALDH)的影響

    醋酸作為醋酸菌發(fā)酵的產(chǎn)物,初始培養(yǎng)基中其存在與否會對發(fā)酵產(chǎn)生一定的影響[14-15],而酶系水平較無底酸的情況下可能會存在一定的差異。在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加底酸,進行發(fā)酵罐發(fā)酵,考察底酸存在下酶系的變化規(guī)律。7L發(fā)酵罐中裝入3.5L發(fā)酵培養(yǎng)基,滅菌后加入4%的乙醇(v/v),同時加入1%的乙酸,按10%的接種量接入種子進行發(fā)酵。定時取樣,結(jié)果分別見圖3及表2。

    圖3 底酸條件下醋酸發(fā)酵特征變化Fig.3 The fermentation feature parameters in the condition of initial acetic acid

    在經(jīng)歷了5h左右的延滯期后,發(fā)酵進入快速生長的對數(shù)期,乙醇也開始被快速消耗,同時酸不斷積累,發(fā)酵進行到20h左右,乙醇基本被氧化殆盡,產(chǎn)酸也基本結(jié)束,菌體此時增長緩慢。和沒有初始底酸的培養(yǎng)條件相比(圖1),發(fā)酵進程明顯加快。同時,ADH和ALDH的酶活水平也出現(xiàn)明顯差異(表2)。

    與在沒有底酸的條件下的發(fā)酵對比,發(fā)酵時間大大縮短,產(chǎn)酸速率得到了較大的提高,發(fā)酵時間縮短到20h左右,說明底酸的存在對發(fā)酵有積極的促進作用。從酶系的變化來看,ADH和ALDH的比酶活都得到了較大的提高,尤其是ALDH的活性水平,最高比酶活提高了有3倍之多,最高酶活達到了7.46U/mg。二者酶活之間的差異變小,由ADH/ALDH從3.3(36h,表1)減小到了1.17(18h,表2)。

    表2 底酸存在下乙醇脫氫酶(ADH)和乙醛脫氫酶(ALDH)的隨時間的變化特征Table 2 The change of ADH and ALDH specific activities in the presence of initial acetic acid

    在乙醇氧化生成乙酸的代謝途徑中,ALDH催化乙醛生成乙酸。底酸(乙酸)的存在可能存在一種反饋激活作用,促進雙酶基因的表達,特別是ALDH,從而大幅提高ALDH的酶活。因此,在生產(chǎn)中,在初始發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一定的酸(1%),提高ADH和ALDH的酶活水平,從而達到促進發(fā)酵、提高生產(chǎn)強度的目的。

    3 結(jié)論

    通過對搖瓶、發(fā)酵罐發(fā)酵對醋酸菌產(chǎn)酸關(guān)鍵酶系進行研究,擬探討其與產(chǎn)酸的關(guān)系。在分批發(fā)酵中,ADH和ALDH的酶活隨發(fā)酵時間的變化而變化,在整個過程中,ADH的酶活要高于ALDH,最高達到3.3倍,并都于36h達到峰值,分別為8.21U/mg和2.52U/mg。1%~3%(v/v)的乙醇對酶系有誘導(dǎo)作用,在此范圍內(nèi),ADH和ALDH的水平明顯提高,但隨著乙醇濃度的增大,對酶活又出現(xiàn)抑制作用。在底酸乙酸存在的發(fā)酵條件下,發(fā)酵時間縮短,產(chǎn)酸關(guān)鍵酶系酶活水平發(fā)生了較大的變化,尤其是ALDH的酶活水平顯著提高,最高達到了7.46U/mg。

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