ALV-J gp85重組蛋白與免疫佐劑聯(lián)合接種雛雞誘導免疫保護的研究

竇文文，李宏梅，成子強，劉建柱，劉海港，井維芳，崔治中，郭慧君

（山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院山東省生物工程與疫病防治重點實驗室，山東泰安 271018）

J亞群禽白血病病毒（Subgroup J avian leukosis virus，ALV-J）是上個世紀90年代從肉雞中鑒定的一種新亞型白血病病毒，它引起骨髓細胞瘤病。中國首次在1999年從白羽肉雞中分離到ALV-J[1]，近年來，ALV-J已傳播到中國不同地區(qū)的某地方品系雞[2-4]及蛋用型雞[5-6]中。ALV-J的感染已在中國雞群中廣泛流行，給中國養(yǎng)雞業(yè)造成嚴重的損失。

為控制ALV-J在中國地方種雞中的流行，需要對我國地方種雞實施凈化。由于我國種雞品系和種群數(shù)量大、飼養(yǎng)不規(guī)范和飼養(yǎng)密集等特點，可能需要較長時間的凈化才能達到感染率非常低的防控要求；此外，還需要借助其他的防制方法降低雞群的ALV-J感染率，以達到加快凈化的目的[5]。使用疫苗預防是一有效的可選擇方法，但對ALV-J至今尚未有有效的疫苗在生產(chǎn)中加以應用。

本研究通過原核表達ALV-J的gp85囊膜蛋白并采用不同免疫佐劑和免疫程序?qū)﹄r雞進行免疫接種，對其免疫保護作用進行研究，為開發(fā)有效的ALV-J亞單位疫苗提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病毒、細胞及實驗動物 ALV-JNX0101株和單克隆抗體（MAb）JE9及DF-1細胞由本實驗室保存；海蘭褐1日齡雛雞購自泰安市東岳種禽場，試驗前進行ALV感染檢測，全部為陰性者進行動物免疫接種試驗。

1.2 質(zhì)粒與菌株 pMD18-T simple vector試劑盒購自TaKaRa公司；pET-32a（+）載體購自Invitrogen公司；大腸桿菌（E.coli）DH5α和BL21（DE3）菌株均由本實驗室保存。

1.3 主要試劑 常用核酸和蛋白等分子試劑購自TaKaRa公司；膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自OMEGA公司；免疫佐劑包括F佐劑和C佐劑，前者購自北京博奧生物有限公司，后者被設計后由寶生物工程（大連）有限公司合成；ALV-J抗原P27 ELISA檢測試劑盒（批號：99-09254）和抗體ELISA檢測試劑盒（批號：99-09268）均購自美國IDEXX公司。

1.4 A LV-J gp85蛋白免疫抗原的制備 根據(jù)GenBank登錄的NX0101株env序列（AY897227）設計引物：5'-CGCGGATCCGGAGTTCATCTGTTGCAAC AACCA-3'（BamHⅠ）和 5'-CCCAAGCTTGGCGCCTG CTACGGCGGTG-3'（HindⅢ），以 NX0101 DNA為模板，按照TaKaRa公司的高保真TaqDNA聚合酶說明書進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析。

PCR產(chǎn)物克隆于pMD18-T載體中，經(jīng)雙酶切、膠回收后亞克隆于pET-32a（+）表達載體中，由北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序，并命名為pET32a（+）-gp85。將其轉(zhuǎn)化E.coliBL21（DE3），用1 mmol/L IPTG 37℃誘導表達，按照分子克隆實驗指南介紹方法純化His-Jgp85蛋白。以J亞群囊膜糖蛋白特異性MAb JE9通過western blot方法檢測重組蛋白的抗原特異性。

1.5 動物免疫保護試驗

1.5.1 試驗設計7日齡海蘭褐公雞60只隨機分為：gp85組，gp85+F組，gp85+F+C組，每組至少10只雞，并設空白質(zhì)粒表達蛋白免疫組6只雞（pET32a組）。每只雞分別腿部肌肉注射0.2 ML（100μg）重組蛋白。gp85組接種免疫蛋白稀釋液，gp85+F組接種免疫蛋白與F佐劑的乳化液，gp85+F+C組接種免疫蛋白、F和C佐劑的混合乳化液，對照組接種滅菌PBS緩沖液，pET32a組每只雞注射同等劑量的表達的空質(zhì)粒蛋白。一免后第3周每組部分雞進行二次加強免疫，免疫方法和劑量同前；二免后第5周進行ALV-JNX0101毒株攻毒保護試驗，除對照組6只雞外其余雞只腹腔注射攻毒，劑量為102.2TCID50/只雞，攻毒后連續(xù)兩周進行病毒血癥檢測和致病性觀察。在首次接種后第1周～第11周每周采集血清，-20℃儲存用于抗體水平檢測。

1.5.2 血清ALV-J抗體檢測用IDEXX公司的ALV-J抗體ELISA檢測試劑盒檢測抗體水平，具體方法見試劑盒說明書。酶標儀檢測樣品OD450nm值，比較各組的抗體水平。

1.5.3 病毒血癥檢測方法參照文獻[6]中相關步驟進行。取接種細胞上清經(jīng)凍融后使用ALV P27抗原ELISA檢測試劑盒按使用說明檢測，并判斷病毒血癥的陰性和陽性。

1.5.4 攻毒后致病性檢測記錄攻毒后3周內(nèi)各試驗組雞只體重變化和剖檢后脾臟、法氏囊等組織重量變化，計算增重和器官發(fā)育指數(shù)；脾臟一部分液氮保存，一部分用于制作組織切片和ALV-JMAb JE9介導的免疫熒光（IFA）檢測。

器官發(fā)育指數(shù)=器官重/體重×100%

1.6 數(shù)據(jù)處理 所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)以平均值±標準誤（X±SD）表示，組間差異性用ANOVA軟件分析，p<0.05表示差異顯著，p<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 重組表達質(zhì)粒的鑒定 利用設計的引物，對ALV-Jgp85基因進行擴增，構建重組質(zhì)粒pET32a-NX0101-Jgp85，對該重組質(zhì)粒進行擴增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，得到一條約為900 bp的特異性片段（圖1A）。該重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后，經(jīng)凝膠電泳分析表明在5.9 kb的載體pET-32a（+）處有一清晰條帶，與預期大小一致；經(jīng)測序后分析表明得到目的基因大小為909 bp，與預期結果相符。證明gp85目的基因已插入表達載體中。

2.2 gp85的誘導表達、純化與免疫原性分析 將重組質(zhì)粒pET32a-NX0101-Jgp85轉(zhuǎn)化至受體菌BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導后進行SDS-PAGE分析，目的蛋白得到高效表達，均為包涵體形式，表達蛋白的相對分子質(zhì)量約為53 ku；使用Ni-NTA純化表達蛋白，經(jīng)純化后得到純度較高的his-gp85重組蛋白（圖1B）；該蛋白經(jīng)western blot分析表明在53 ku相應的位置出現(xiàn)一條清晰的免疫反應帶，表明E.coli表達的gp85重組蛋白與ALV-J亞群MAb JE9[7]發(fā)生特異性結合（圖1C）。

圖1 pET32a-NX0101-Jgp85重組質(zhì)粒的PCR擴增（A）及其重組蛋白的純化（B）和western blot分析（C）Fig.1 PCR amplification（A）,purification（B）and specificity analysis（C）of recombinant protein

2.3 不同免疫佐劑和免疫次數(shù)對gp85重組蛋白誘導生成抗體的作用 使用ALV-J抗體試劑盒檢測接種后雞只生成抗體變化的結果（圖2）。

圖2 不同免疫佐劑和免疫次數(shù)對gp85重組蛋白誘導抗體的影響Fig.2 Effect of different adjutants and inoculated numbers on the antibodies induced by the recombinant protein of gp85

圖中顯示gp85+F組和gp85+F+C組在一免和二免后ALV-J陽性血清抗體顯著高于gp85重組蛋白免疫組，gp85免疫組在一次免疫后陽性血清僅維持大約7 d時間；二次加強免疫后陽性血清抗體維持約28 d，并且最高效價較低。gp85+F組免疫后，一免后抗體從第7 d開始上升，第14 d達到最高，隨后下降，至第56 d；二免后能夠維持并繼續(xù)促進抗體生成至第42 d達到最高，隨后下降至第77 d試驗觀察結束仍有較高的抗體。gp85+F+C組抗體具有相似的變化規(guī)律，所不同的是抗體下降速度慢，抗體效價總體高于gp85+F組。另外，二次免疫也進一步促進抗體的生成，并維持時間進一步延長。

2.4 不同免疫佐劑和免疫次數(shù)對gp85重組蛋白誘導抗體陽性雞只比例的變化 經(jīng)一免后的雞只，gp85組抗體陽性率較低，最高僅有50%；gp85+F組從第14 d開始全部產(chǎn)生抗體，直到第49 d，隨后降低；gp85+F+C組從第21 d全部雞只產(chǎn)生抗體，到攻毒時第56 d有80%的雞只有陽性血清抗體。經(jīng)二免后，gp85免疫組，抗體陽性率有所升高，在28 d～42 d期間達到80%以上；gp85+F組可以在免疫后第14 d至第63 d全部產(chǎn)生抗體，而gp85+F+C組可以在第28 d至第77 d全部產(chǎn)生抗體。試驗結果顯示二次免疫和所用兩種免疫佐劑可以增強雞只對重組蛋白免疫的免疫原性。

2.5 不同免疫的雞只攻毒后病毒血癥的變化 使用CEF和DF1細胞對攻毒后雞只的血漿進行病毒分離，檢測病毒陽性比例；并統(tǒng)計不同雞只抗體存在情況（表1）。未免疫攻毒組病毒血癥陽性率為87.5%，gp85免疫組為66.7%；gp85+F組為46.2%，gp85+F+C組為33.3%；以上3個免疫接種組免疫保護率分別為33.3%、53.8%和66.7%。其中所免疫保護雞只中抗體陽性比例為16/19（84.2%），抗體陰性比例為3/19（15.8%）；未被保護的雞只中抗體陰性比例為 12/18（66.7%）。

表1 攻毒后第2周不同病毒血癥和抗體雞只的比例（率）Table 1 The ratios of chickensw ith different viremia and antibody at the second week after challenge by ALV-J

2.6 不同免疫的雞只攻毒后健康狀況檢測 表2顯示各試驗組在攻毒后3周時間內(nèi)體重變化、脾臟和法氏囊發(fā)育變化，由于組間個體差異較大，體重變化和增重變化沒有顯著差異，但使用gp85+F+C組雞增重比未免疫未攻毒組增長69%，比未免疫攻毒組增長107%；其它免疫組均比未免疫攻毒組有所升高，但比未免疫未攻毒組降低。未免疫攻毒處理的雞只脾臟和法氏囊凈重和發(fā)育指數(shù)比未攻毒組雞只有所下降，gp85免疫組脾臟凈重和發(fā)育指數(shù)進一步降低，使用免疫佐劑聯(lián)合免疫的雞只升高；gp85+F+C組法氏囊凈重和發(fā)育指數(shù)比攻毒組升高，但仍低于未攻毒對照組。

表2 攻毒后3周體重和主要免疫器官發(fā)育指數(shù)的變化Table 2 Changes of body weight and main immune organs during 3 weeks after challenge by ALV-J

在攻毒后3周內(nèi)，未免疫未攻毒組雞只沒有死亡，剖檢未見明顯腫瘤變化；未免疫攻毒組死亡一只，其余均出現(xiàn)消瘦、冠蒼白、采食量下降等癥狀；gp85組在攻毒后死亡4只；gp85+F+C組死亡4只；gp85+F+C組死亡2只。經(jīng)ALV-JMAb介導的IFA檢測以上死亡雞只和未免疫攻毒雞只的脾臟組織顯示有大量特異性熒光出現(xiàn)；而免疫處理組未死亡的雞只精神狀態(tài)較好，未見發(fā)育異常，脾臟組織切片經(jīng)IFA檢測未見特異性熒光。

3 討 論

本研究利用ALV-J囊膜蛋白gp85基因經(jīng)原核表達制備其重組蛋白，利用該表達蛋白作為免疫原，對雛雞免疫能夠產(chǎn)生一定的抗體，但維持時間短、抗體效價低。這與先前報道中所遇到的問題是相同的[8]，而利用F佐劑與gp85表達蛋白制備成免疫乳化劑后免疫提高了ALV-J抗體滴度和維持時間；同時使用二次加強免疫可以進一步促進ALV-J抗體的產(chǎn)生，高效價抗體可維持到第9周。

C佐劑是一種核酸佐劑，可以激活Toll樣受體，誘導機體產(chǎn)生非特異性免疫反應[9]。近年來一些文獻有關該佐劑促進亞單位疫苗和DNA疫苗誘導雞體產(chǎn)生體液免疫反應的報道較多[10-11]；但在ALV-J方面的研究還未見報道。本研究利用該佐劑與F佐劑制備成乳化佐劑，與gp85聯(lián)合免疫能夠進一步促進gp85基因表達產(chǎn)物免疫雞產(chǎn)生高效價抗體，維持時間在F佐劑基礎上又進一步延長，抗體下降速度減緩；二次加強免疫后，高效價抗體可以維持到11周。本研究再次證明了該佐劑具有促進原核表達蛋白免疫原性的作用，是一種極具潛力的免疫佐劑。

使用病毒株ALV-JNX0101攻毒，觀察免疫接種后免疫保護作用?？梢钥闯鲆欢▌┝康腁LVJNX0101對60日齡的雞只也產(chǎn)生一定的免疫抑制和免疫器官發(fā)育障礙、甚至死亡等致病性。接種后的雞只產(chǎn)生不同保護力，特別是利用佐劑免疫的雞只，病毒血癥雞只減少，免疫器官發(fā)育得到改善；所被保護的雞只gp85抗體陽性率達84.2%，而病毒血癥為陽性的個體中抗體為陰性卻占66.7%，表明所產(chǎn)生的免疫保護作用與針對gp85抗體有直接的關系。值得注意的是本研究表明病毒血癥為陽性的個體，其血清中也具有較高gp85蛋白的抗體，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因上值得進一步研究。

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