SAMHD1蛋白單克隆抗體的制備及SAMHD1在不同細(xì)胞中的表達(dá)鑒定

戈 曼，吳星亮，尹 鑫，魏 萍，王曉鈞*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/大動(dòng)物病研究室，黑龍江哈爾濱 150001）

SAMHD1為鼠γ干擾素誘導(dǎo)基因Mg11的類似物，具有脫氧核苷三磷酸水解酶的功能，最近被鑒定為人免疫缺陷病毒（HIV-1）的限制性因子[1]。SAMHD1在樹突狀細(xì)胞和其他髓系細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài)，并通過干擾病毒DNA的高效合成抑制前期的病毒復(fù)制，具有先天免疫功能。SAMHD1同時(shí)與一種以慢性腦脊髓炎流質(zhì)淋巴細(xì)胞增多癥的病因有關(guān)[2]，能夠增高IFN-α的水平[3]。huSAMHD1基因全長(zhǎng)約1 878 bp，其編碼的huSAMHD1可以降解巨噬細(xì)胞內(nèi)的大部分dNTP，在低水平的dNTP環(huán)境中HIV-1的反轉(zhuǎn)錄和cDNA的形成過程被有效抑制，而且HIV-1不能夠感染髓系細(xì)胞[4-5]。而HIV-2和相關(guān)的免疫缺陷病毒（SIVsm/mac）則能夠通過其編碼的Vpx蛋白降解SAMHD1，從而越過骨髓細(xì)胞內(nèi)的保護(hù)機(jī)制感染易感動(dòng)物[6]。本研究通過原核表達(dá)huSAMHD1可溶性重組蛋白huSAMHD1，制備抗huSAMHD1的單克隆抗體（MAb），為深入研究SAMHD1的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 重組質(zhì)粒、細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 原核及真核表達(dá)SAMHD1的重組質(zhì)粒 pET-huSAMHD1、pcDNA-huSAMHD1（人）和 pcDNA-eqSAMHD1（馬）及 pcDNA-macSAMHD1（猴）由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；人單核細(xì)胞（THP-1）和人白血病細(xì)胞（U937）購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所；SP2/0、293T、兔腎細(xì)胞、馬及驢皮膚細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；BALB/c小鼠購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑 HAT選擇性培養(yǎng)基、HT選擇性培養(yǎng)基、弗氏完全佐劑（FCA）、弗氏不完全佐劑（FICA）、IRD標(biāo)記的羊抗鼠IgG（IRD-IgG）、羊抗鼠熒光二抗（FITC-IgG）及PEG-4000均購(gòu)自Sigma公司；HiTrapProteinG HP購(gòu)自GE公司；羊抗鼠HRP-IgG、兔抗鼠SAMHD1 MAb購(gòu)自Abcam公司；抗體亞類鑒定試劑盒購(gòu)自Southern Biotechnology公司。

1.3 huSAMHD1蛋白的表達(dá)與純化 將pET-huSAMHD1轉(zhuǎn)化于E.coliRosetta中，在15℃誘導(dǎo)16 h進(jìn)行huSAMHD1的表達(dá)，經(jīng)鎳柱純化，并以兔抗鼠 SAMHD1（1∶5 000）為一抗，羊抗鼠 IRD-IgG（1∶10 000）進(jìn)行 western blot鑒定。

1.4 動(dòng)物免疫 將純化的huSAMHD1與等體積的FCA乳化，經(jīng)腹腔接種4周齡BALB/c小鼠（100 ug/只）。以后每間隔2周將免疫原與等體積的FICA乳化進(jìn)行免疫，共免疫3次。在三免后一周用不加佐劑的抗原加強(qiáng)免疫（100 ug/只）。3 d后取小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。

1.5 間接ELISA檢測(cè)方法的建立 以huSAMHD1作為包被抗原，采用棋盤滴定法建立檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液的間接ELISA方法，以P/N值大于2.1的抗原和抗體稀釋度作為兩者的最佳工作濃度。

1.6 細(xì)胞融合及雜交瘤細(xì)胞的篩選 將免疫鼠的脾細(xì)胞與SP2/0采用PEG-4000進(jìn)行融合，利用建立的ELISA方法進(jìn)行篩選。并進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞克隆純化。

1.7 腹水的制備及效價(jià)的測(cè)定 具體步驟按照參考文獻(xiàn)[7]的方法，并采用HiTrapProteinG進(jìn)行純化。

1.8 MAb免疫球蛋白亞類鑒定 利用抗體亞類鑒定試劑盒對(duì)MAb進(jìn)行亞類鑒定。

1.9 MAb的鑒定 將pcDNA-huSAMHD1利用磷酸鈣方法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞并將其裂解，以羊抗鼠HRP-IgG作為二抗（1:40 000），對(duì)MAb進(jìn)行western blot鑒定。

1.10 MAb的間接免疫熒光（IFA）鑒定 具體步驟按照參考文獻(xiàn)[8]的方法。

1.11 SAMHD1在不同細(xì)胞中的表達(dá)鑒定 采用western blot分別檢測(cè)人、猴、馬表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的真核表達(dá)產(chǎn)物與未轉(zhuǎn)染的293T及空載體轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞作為陰性對(duì)照，并分別檢測(cè)其他種屬細(xì)胞的反應(yīng)情況。

2 結(jié)果及討論

2.1 huSAMHD1原核表達(dá)、純化及western blot鑒定 將重組菌在15℃誘導(dǎo)16 h后，huSAMHD1獲得到大量的可溶性表達(dá)，純化的huSAMHD1經(jīng)SDS-PAGE和western blot鑒定結(jié)果顯示，其分子約為79 ku，與預(yù)期相符（圖1）。

圖1 純化重組蛋白的SDS-PAGE及western blot分析Fig.1 SDS-PAGE and western blot analysis of purified protein

2.2 雜交瘤細(xì)胞株的建立 免疫的BALB/c鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合后，經(jīng)間接ELISA篩選及4次細(xì)胞克隆純化，獲得1株能穩(wěn)定分泌抗huSAMHD1蛋白的雜交瘤細(xì)胞株，命名為huSAMHD1MAb。

2.3 MAb效價(jià)及MAb免疫球蛋白亞類鑒定 經(jīng)間接ELISA測(cè)定huSAMHD1 MAb在4代細(xì)胞培養(yǎng)后上清液及腹水效價(jià)最高分別為 1:640，1:106，huSAMHD1 MAb亞型為IgG2b/κ鏈。

2.4 MAb的western blot鑒定 用huSAMHD1MAb檢測(cè)pcDNA-huSAMHD1轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的真核表達(dá)產(chǎn)物。檢測(cè)結(jié)果表明，huSAMHD1MAb可以識(shí)別表達(dá)產(chǎn)物，其大小與huSAMHD1蛋白（79 ku）相符，而且與空載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的表達(dá)產(chǎn)物呈陰性反應(yīng)（圖 2）。

圖2 MAb對(duì)huSAMHD1在293T細(xì)胞中表達(dá)的western blot鑒定Fig.2 Identification of the MAb to huSAMHD1 expressed in 293 cells by western blot

2.5 MAb的IFA鑒定 將pcDNA-huSAMHD1轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，以羊抗鼠FITC-IgG為二抗，對(duì)制備的MAb雜交瘤細(xì)胞上清液進(jìn)行鑒定。檢測(cè)結(jié)果顯示，MAb與huSAMHD1真核表達(dá)的蛋白呈陽(yáng)性反應(yīng)。

圖3 MAb對(duì)huSAMHD1在293T細(xì)胞中表達(dá)的IFA鑒定Fig.3 Identification of the MAb to huSAMHD1 expressed in 293 cells by IFA

2.6 SAMHD1在不同細(xì)胞中的表達(dá)鑒定 采用huSAMHD1 MAb分別檢測(cè)人、猴、馬SAMHD1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的表達(dá)產(chǎn)物，以未轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞作為陰性對(duì)照，同時(shí)檢測(cè)馬、驢皮膚細(xì)胞、兔腎細(xì)胞、THP-1和U937細(xì)胞SAMHD1的表達(dá)情況。檢測(cè)結(jié)果表明，huSAMHD1 MAb只識(shí)別pcDNA-huSAMHD1轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞表達(dá)的huSAMHD1以及天然表達(dá)huSAMHD1的THP-1細(xì)胞，目的蛋白約79 ku，而與猴、馬pcDNA-SAMHD1和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞以及馬、驢皮膚細(xì)胞、兔腎細(xì)胞、293T和U937細(xì)胞均無特異性反應(yīng)（圖4）。

人、猴及馬SAMHD1序列比對(duì)顯示，其同源性達(dá)到90%，商品化的抗huSAMHD1 MAb可以與猴、馬SAMHD1的真核表達(dá)蛋白反應(yīng)。本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的huSAMHD1制備的MAb僅具有識(shí)別相同種屬的SAMHD1特異性，而與其他種屬的SAMHD1無交叉反應(yīng)，表明該MAb具有良好的種屬特異性，為進(jìn)一步研究huSAMHD1分子的功能提供有效的工具。

圖4 huSAMHD1 MAb特異性鑒定及SAMHD1在不同細(xì)胞中的表達(dá)鑒定Fig.4 Specific identification of the MAb in different cells by western blot

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