豬流行性腹瀉病毒N蛋白核仁定位信號(hào)對(duì)宿主細(xì)胞周期的影響

劉隨新，石 達(dá)， 陳建飛， 張 鑫，時(shí)洪艷，劉孝珍,2，張 莎,2，王 璐，馮 力*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/豬傳染病研究室，黑龍江哈爾濱 150001；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150030）

豬流行性腹瀉（Porcine epidem ic diarrhea，PED）是由PED病毒（PEDV）引起的一種急性高度接觸性腸道傳染病，以腸炎為主要特征，對(duì)仔豬致死率高達(dá)90%[1]，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

PEDV屬于α冠狀病毒屬，基因組為具有感染性的單股正鏈RNA，5'端具有帽子結(jié)構(gòu)，3'端具有Poly（A）序列。PEDV主要的結(jié)構(gòu)蛋白包括：纖突蛋白（S）、膜蛋白（M）、核衣殼蛋白（N）和小膜蛋白（E）[2]。其中PEDV N蛋白是一種磷酸化的并富含堿性氨基酸的結(jié)構(gòu)蛋白，可以定位于細(xì)胞的核仁中，同時(shí)推測(cè)N蛋白可能參與細(xì)胞核仁的功能調(diào)節(jié)，干擾宿主細(xì)胞的周期，從而為病毒的復(fù)制提供條件[3-5]。

本研究根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期工作鑒定的核仁定位信號(hào)，構(gòu)建核仁定位信號(hào)缺失重組質(zhì)粒pAc-GFP-dN，轉(zhuǎn)染Vero E6細(xì)胞，利用激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)觀察核仁定位信號(hào)缺失的N蛋白的定位情況和轉(zhuǎn)染細(xì)胞的周期變化，進(jìn)而為N蛋白核仁定位信號(hào)對(duì)宿主細(xì)胞的影響提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為進(jìn)一步研究PEDV的致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 重組質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞 含有編碼PEDV N基因的重組質(zhì)粒pMD-N、真核表達(dá)載體pAc-GFP-C1、感受態(tài)E.coliDH5α和Vero E6細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購自美國NEB公司；PrimerSTAR HS DNA聚合酶購自寶生物工程（大連）有限公司；LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司；DMEM培養(yǎng)基、OPTI-MEM培養(yǎng)基和胎牛血清均購自Hyclone公司；質(zhì)粒抽提試劑盒和膠回收試劑盒購自QIAGEN公司；細(xì)胞培養(yǎng)板購自Greierbio-one公司。

1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 根據(jù)PEDV CV777株 N基因的全序列設(shè)計(jì)引物 N1U、N1L、N2U、N2L。以N1U和 N2L引物[N1U：5'-CCCAAGCTT ACCATGGCTTCTGTCAGCTTTC-3'（HindⅢ），N2L：5'-GGGCGGGATCCTTAATTTCCTGTGTCGGAG-3'（BamHⅠ）]，擴(kuò)增N基因，大小為1 326 bp。

核仁定位信號(hào)序列編碼區(qū)位于N基因的211 bp～270 bp，共60 bp，N基因中核仁定位信號(hào)上游序列命名為N1，大小為210 bp，PCR擴(kuò)增引物為N1U和N1L（5'-CAGAAAACACCCTCAGTACGAGGTTGT TCAATTCGCTCAC-3'）；核仁定位信號(hào)下游序列命名為N2，大小為1 056 bp，PCR擴(kuò)增引物為N2U（5'-GTGAGCGAATTGAACAACCTCGTACTGAGGG TGTTTTCTGG-3'）和N2L。將分別擴(kuò)增的N1和N2按照凝膠回收試劑盒說明書進(jìn)行凝膠回收，并以其為模板，以N1U和N2L為引物利用SOE-PCR的方法擴(kuò)增核仁定位信號(hào)序列缺失基因dN。。

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物dN和N基因采用凝膠回收，將兩種回收產(chǎn)物和pAC-GFP-C1載體分別進(jìn)行HindⅢ和BamHⅠ雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，按照5∶1的分子比例16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDH5α，培養(yǎng)后，提取重組質(zhì)粒，由上海英俊生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.4 轉(zhuǎn)染Vero E6細(xì)胞 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于60%～80%融合度的無抗生素培養(yǎng)的Vero E6細(xì)胞中。按LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

1.5 共聚焦顯微鏡分析 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后，棄培養(yǎng)液，細(xì)胞用冰預(yù)冷的50%甲醇和50%丙酮的固定液室溫固定15 min，用PBS漂洗3次，每次5min，自然干燥，加入DAPI（100μg/mL），于4℃避光染核15 min，PBS漂洗3次，利用激光共聚焦顯微鏡分析核仁定位信號(hào)缺失后N蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位情況。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)宿主細(xì)胞周期的變化 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后，棄培養(yǎng)液，用胰酶消化于1.5 ML離心管中，2 000 r/min 4℃離心5 min，PBS漂洗3次。按照說明書進(jìn)行細(xì)胞的染核，利用流式細(xì)胞儀（FASCAria）檢測(cè)細(xì)胞周期的變化。

2 結(jié) 果

2.1 N基因和dN基因的擴(kuò)增 以pMD-N為模板，利用設(shè)計(jì)的特異引物擴(kuò)增得到與預(yù)期大小相符的dN和N基因（圖1）。

2.2 激光共聚焦顯微鏡分析dN蛋白在細(xì)胞中的定位情況 將pAc-GFP、pAc-GFP-N及pAc-GFP-dN分別轉(zhuǎn)染于Vero E6細(xì)胞中，48 h后，利用激光共聚焦顯微鏡分析。激光共聚焦顯微鏡圖片顯示，在轉(zhuǎn)染空載體pAc-GFP細(xì)胞中可以在細(xì)胞核質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)中觀察到綠色熒光，在轉(zhuǎn)染pAc-GFP-N的細(xì)胞中，可以在細(xì)胞核仁及細(xì)胞質(zhì)中觀察到綠色熒光，而在轉(zhuǎn)染pAc-GFP-dN的細(xì)胞中，則只能在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)綠色熒光（圖2），結(jié)果表明核仁定位信號(hào)的缺失導(dǎo)致dN蛋白喪失了在細(xì)胞核仁中定位的能力。

圖1 dN和N基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification of N and dN genes by PCR

圖2 激光共聚焦分析dN蛋白在細(xì)胞漿中的定位結(jié)果Fig.2 The subcellular localization of the expressed dN protein in cytoplasm of the transfected Vero E6 cells by confocal Microscope observation

2.3 細(xì)胞流式儀檢測(cè)dN蛋白對(duì)細(xì)胞的周期變化影響 將pAc-GFP、pAc-GFP-N及pAc-GFP-dN分別轉(zhuǎn)染于Vero E6細(xì)胞中，48 h后，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果表明，空白細(xì)胞對(duì)照組G0/G1期、S期及G2/M期細(xì)胞分別為60.4%、15.9%和10.1%；空載體對(duì)照組G0/G1期、S期及G2/M期細(xì)胞分別為58.1%、13.9%，13.4%；在轉(zhuǎn)染pAc-GFP-N細(xì)胞中G0/G1期、S期及G2/M期分別為57.9%、13.5%和20.5%，與空白細(xì)胞對(duì)照組，空載體對(duì)照組相比較顯示：G2/M期明顯增多。而轉(zhuǎn)染pAc-GFP-dN細(xì)胞中G2/M期細(xì)胞則與正常對(duì)照組細(xì)胞相似，G0/G1期為61.9%，S期為12.0%，G2M期為11.9%（圖3）。結(jié)果表明N蛋白可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，使其在G2M期出現(xiàn)停滯現(xiàn)象，而核仁定位信號(hào)缺失之后，N蛋白喪失了使宿主細(xì)胞周期在G2/M期停滯的能力，表明N蛋白核仁定位信號(hào)在宿主細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中起到重要作用。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)dN蛋白對(duì)細(xì)胞周期影響結(jié)果Fig.3 Effection of the expressed dN protein on cell cycle by Flow Cytometry

3 討 論

N蛋白為冠狀病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，由377個(gè)至455個(gè)氨基酸組成，以具有高等電點(diǎn)、高絲氨酸含量為特征，是一種多功能的磷酸化蛋白，與病毒基因組RNA相互纏繞形成核衣殼，有6個(gè)～7個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，3個(gè)相對(duì)保守的結(jié)構(gòu)域，位于中間的一個(gè)結(jié)構(gòu)域能夠與病毒的RNA前導(dǎo)序列結(jié)合，在病毒RNA合成過程中發(fā)揮著重要的作用。在感染病毒細(xì)胞中，N蛋白是表達(dá)量最高的病毒蛋白之一[6-8]。

作為單股正鏈RNA病毒，PEDV可以在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中完成所有的復(fù)制過程，但研究表明，在宿主細(xì)胞的細(xì)胞核中也可以發(fā)現(xiàn)病毒的N蛋白，這表明N蛋白中存在引導(dǎo)蛋白到細(xì)胞核中定位的信號(hào)，N蛋白借助這些信號(hào)和載體蛋白相互作用從而進(jìn)入細(xì)胞核。大量的研究表明N蛋白借助核（核仁）定位信號(hào)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核仁中參與細(xì)胞分離期的調(diào)節(jié)，從而有利于病毒的復(fù)制。Chen等研究推斷人呼吸系統(tǒng)冠狀病毒（SARS-CoV）N蛋白與核仁蛋白和纖維蛋白相互作用，使其重新分布，并抑制細(xì)胞的分裂[9]，Wurm等推定鼠肝炎病毒和豬傳染性胃腸炎病毒N蛋白可能延遲細(xì)胞周期來創(chuàng)造有利病毒復(fù)制的適宜條件[10-13]。

本研究根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期鑒定的核仁定位信號(hào)，即位于N基因的核苷酸序列的第211位～270位，共60個(gè)核苷酸，利用激光共聚焦顯微鏡觀察，確定缺失核仁定位信號(hào)的N蛋白喪失了在細(xì)胞核仁中定位的功能；并進(jìn)行流式細(xì)胞儀的檢測(cè)，可觀察到轉(zhuǎn)染含有完整核仁定位信號(hào)的N蛋白后，宿主細(xì)胞在G2/M期明顯增加，而轉(zhuǎn)染缺失核仁定位信號(hào)的dN蛋白的細(xì)胞，與正常細(xì)胞相似，在G2/M期無明顯增加的現(xiàn)象。這與其他冠狀病毒N蛋白對(duì)宿主細(xì)胞周期的影響相似，表明N蛋白通過在核仁中定位來調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的周期變化，從而有利于病毒在其體內(nèi)的復(fù)制。同時(shí)對(duì)核仁定位信號(hào)的初步分析為進(jìn)一步研究PEDV致病機(jī)制的闡明和基因疫苗的研制提供了新的依據(jù)。

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