黑火藥煙霧致吸入性肺損傷大鼠模型的建立與評(píng)價(jià)

劉一凡，唐紅衛(wèi)，吳小利，謝尹晶，張洪瑞，段晉燕，向代軍，蘭曉梅，李綿洋，王成彬，李登清

在戰(zhàn)爭或軍事演習(xí)的特殊環(huán)境中，火藥通常被用于掩護(hù)我方﹑攻擊敵方或模擬實(shí)戰(zhàn)環(huán)境?；鹚幵诒īp燃燒過程中會(huì)釋放大量的有毒氣體﹑粉塵及顆粒，軍事人員極易因長期暴露于此環(huán)境而引發(fā)急性呼吸道和肺損傷，如化學(xué)性肺水腫﹑吸入性肺炎等，嚴(yán)重者甚至發(fā)展為呼吸衰竭[1]。黑火藥是軍事活動(dòng)中常用的彈藥材料，因其煙霧的致傷因素復(fù)雜，目前其致傷機(jī)制研究僅限于體外實(shí)驗(yàn)[2]，若要進(jìn)一步探索黑火藥煙霧導(dǎo)致的肺部損害的發(fā)病機(jī)制﹑藥物預(yù)防及治療效果評(píng)價(jià)，尚需構(gòu)建穩(wěn)定﹑可靠的動(dòng)物模型。為此，本研究在火藥煙霧吸入毒理學(xué)分析平臺(tái)的基礎(chǔ)上改進(jìn)裝置[3]，構(gòu)建火藥煙霧致吸入性肺損傷的大鼠模型，并對該模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性Wistar大鼠，體重210～230g，由解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK(京)2012-0001。大鼠于動(dòng)物中心清潔房中飼養(yǎng)，溫度21～24℃，濕度50%～60%，晝夜12h節(jié)律，自由進(jìn)食﹑飲水。

1.2 儀器及設(shè)備

1.2.1 火藥煙霧發(fā)生裝置 由煙霧發(fā)生室和動(dòng)物煙熏室兩部分組成，材質(zhì)均為聚乙烯。煙霧發(fā)生室內(nèi)徑32cm×28cm×34cm ，內(nèi)置遙控電磁加熱器﹑發(fā)煙盤﹑氣泵(輸出功率150W)，其頂蓋距邊線10cm處分別接有3個(gè)直徑為5cm的導(dǎo)煙管，其中1個(gè)導(dǎo)煙管一端與緩沖袋相連，另外2個(gè)導(dǎo)煙管與氣泵兩端相連，作為推動(dòng)兩室氣體循環(huán)流動(dòng)的通道。動(dòng)物煙熏室內(nèi)徑32cm×24cm×34cm，側(cè)壁有供氣體檢測儀和溫度檢測儀采樣的端口(圖1)。

圖1 火藥煙霧發(fā)生裝置模型示意圖Fig. 1 Schematic layout of smog-generating device

1.2.2 火藥成分 依據(jù)民用黑火藥國家標(biāo)準(zhǔn)GB18450-2001配制火藥，即按質(zhì)量百分比將75%硝酸鉀(分析純，北京化學(xué)試劑公司)﹑10%硫黃粉(純度99.9%，200目，北京西四化工原料公司)﹑15%碳粉(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司)分別研磨后混勻，并經(jīng)100目篩過濾，37℃干燥24h后收集于潔凈塑料盒中密封保存。

1.2.3 氣體成分及溫度檢測 采用一氧化碳檢測儀CO-180(北京金泰科儀檢測儀器有限公司)檢測CO濃度，泵吸式紅外二氧化碳?xì)怏w分析儀(北京寶云興業(yè)科貿(mào)有限公司)檢測CO2濃度，GDYK-402S空氣現(xiàn)場二氧化硫測定儀(長春吉大小天鵝儀器有限公司)檢測SO2濃度，GDYK-101S空氣現(xiàn)場硫化氫速測儀(長春吉大小天鵝儀器有限公司)檢測H2S濃度，溫度快速檢測儀(長春吉大小天鵝儀器有限公司)測定煙霧溫度。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 火藥劑量﹑暴露時(shí)間與死亡率的關(guān)系 ①將大鼠在固定煙熏時(shí)間(21min)的條件下分別暴露于不同火藥劑量(5﹑7.5﹑9﹑10﹑11﹑12.5﹑15g)所產(chǎn)生的煙霧中；②將大鼠在固定煙霧濃度(火藥劑量為10g)的條件下分別放置不同時(shí)間(8﹑9﹑10﹑15﹑21min)。記錄并分析整個(gè)煙熏過程中及煙熏處理后連續(xù)4d內(nèi)大鼠的死亡情況。

1.3.2 肺損傷模型 42只Wistar大鼠隨機(jī)分為對照組和建模后1﹑2﹑6﹑24﹑48﹑96h組(n=6)，建模組大鼠置于密閉的動(dòng)物煙熏箱并在10g火藥產(chǎn)生的煙霧中暴露8min，然后依據(jù)分組在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死。對照組大鼠暴露于動(dòng)物煙熏箱的空氣中8min，于暴露后96h處死。

“專業(yè)發(fā)展環(huán)境”主要用來衡量學(xué)校的整體氛圍對教師專業(yè)發(fā)展的影響。有關(guān)要素包括：學(xué)校領(lǐng)導(dǎo)對教師專業(yè)發(fā)展的重視程度和其他管理層的態(tài)度；學(xué)習(xí)與研修場所；外聘專家來校指導(dǎo)；教師外出學(xué)習(xí)、經(jīng)費(fèi)等。其中，除了“外出學(xué)習(xí)機(jī)會(huì)與經(jīng)費(fèi)”的認(rèn)可度接近高，其他要素的認(rèn)可度均為高。

1.4 煙熏處理 稱固定質(zhì)量的火藥放入發(fā)煙室的不銹鋼發(fā)煙盤中，置于遙控電磁加熱器上，上方扣上安全網(wǎng)蓋，每次于動(dòng)物煙熏室中放入裝有2只待處理大鼠的動(dòng)物籠，蓋緊，打開兩室內(nèi)風(fēng)扇，并關(guān)閉裝置頂蓋，檢查氣密情況，使用遙控裝置將電磁加熱器調(diào)至功率最大擋位，火藥燃盡至無明火后，關(guān)閉電磁加熱器，并啟動(dòng)氣泵。待暴露時(shí)間到達(dá)后，打開煙熏箱取出大鼠，置于空氣中。

1.5 觀測指標(biāo)

1.5.1 煙霧中CO﹑CO2﹑SO2﹑H2S濃度及溫度 檢測火藥燃燒后3﹑9﹑12min時(shí)各氣體成分的濃度及煙霧的溫度。

1.5.2 臨床表現(xiàn) 觀察大鼠在吸入煙霧過程中及煙熏結(jié)束后的呼吸情況﹑活動(dòng)情況及精神狀態(tài)﹑發(fā)紺程度等。

1.5.3 動(dòng)脈血?dú)?在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)用4%水合氯醛(1ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，暴露分離腹主動(dòng)脈，取血1ml后放血處死大鼠，于半小時(shí)內(nèi)進(jìn)行動(dòng)脈血?dú)夥治觥?/p>

1.5.4 肺濕/干比(W/D) 取右肺前葉﹑中葉，用濾紙拭干表面血液，以電子天平稱重(濕重)，然后放入60℃烘箱烘烤48h至恒重，電子天平稱重(干重)，計(jì)算W/D值。

1.5.5 支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)白細(xì)胞計(jì)數(shù)及蛋白含量測定 腹主動(dòng)脈放血處死大鼠后，打開胸腔，分離主支氣管，夾閉右主支氣管，在主支氣管切開處置入自制灌洗針并結(jié)扎固定，用4℃生理鹽水2.5ml行左肺灌洗，重復(fù)3次，記錄回收量。BALF經(jīng)1500r/min離心10min，收集上清液，BAC法測定總蛋白含量，取沉淀重懸于1ml生理鹽水，進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.5.6 肺組織病理學(xué)檢查 打開胸腔后觀察肺組織大體病理改變，取右肺后葉浸入4%中性甲醛溶液中固定24h，石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，常規(guī)HE染色后光鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布及方差齊性的計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，建模組與對照組比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 火藥劑量﹑暴露時(shí)間與死亡率的關(guān)系 將暴露時(shí)間固定為21min，火藥劑量為5g時(shí)未見大鼠死亡，火藥劑量從7.5g增高到10g時(shí)，大鼠死亡率自12.5%增至77.8%，當(dāng)火藥劑量為15g時(shí)，死亡率達(dá)到100%。當(dāng)固定火藥劑量為10g時(shí)，死亡率隨暴露時(shí)間延長而增加，暴露時(shí)間為8min時(shí)，煙熏處理后4d內(nèi)未見大鼠死亡，而當(dāng)時(shí)間增至21min時(shí)，4d內(nèi)大鼠死亡率達(dá)到77.8%。

2.2 煙霧中CO﹑CO2﹑SO2﹑H2S濃度及溫度測定結(jié)果 10g黑火藥完全形成煙霧后3﹑9﹑12min，動(dòng)物煙熏箱中CO﹑CO2﹑SO2﹑H2S濃度及溫度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表1)。

表1 煙霧形成后不同時(shí)間點(diǎn)氣體濃度﹑溫度變化(±s，n=10)Tab. 1 Smog concentration and temperature at each time point after smog emergence (±s, n=10)

表1 煙霧形成后不同時(shí)間點(diǎn)氣體濃度﹑溫度變化(±s，n=10)Tab. 1 Smog concentration and temperature at each time point after smog emergence (±s, n=10)

CO. 1ppm=2.86×10-8mol/L; H2S. 1ppm=1.94×10-8mol/L; SO2.1ppm=5.47×10-9mol/L

Time(min)CO2(%) CO(ppm) H2S(ppm)SO2(ppm) T(℃)3 2.04±0.11 249.67±16.07 0.51±0.09 1.36±0.02 27.40±0.70 9 2.11±0.10 243.00±14.73 0.48±0.04 1.36±0.02 26.40±1.29 12 1.97±0.09 239.33±5.5 0.43±0.03 1.37±0.03 26.00±1.14

2.3 臨床表現(xiàn) 對照組大鼠至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)無異常，精神可，反應(yīng)靈活，活動(dòng)正常，體毛光滑，呼吸平穩(wěn)。建模組大鼠在煙熏處理后立即出現(xiàn)呼吸急促﹑張口呼吸并伴隨口鼻分泌物增多，可聞及因呼吸困難產(chǎn)生的嗚咽聲，四肢﹑口唇處可見發(fā)紺。煙熏處理1h后，建模組大鼠呼吸由急促變深大，呼吸困難及發(fā)紺癥狀稍減輕，至煙熏后96h均表現(xiàn)為精神萎靡，反應(yīng)差，活動(dòng)少，毛發(fā)無光澤并伴有深大呼吸。

2.4 動(dòng)脈血?dú)夥治鼋Y(jié)果 對照組大鼠PaO2為83.27±4.99mmHg，煙霧吸入1h后，建模組大鼠PaO2迅速降至47.79±13.28mmHg，6h后逐漸升高至64.10±12.61mmHg，但仍顯著低于對照組(P＜0.05)，至96h仍未恢復(fù)至對照組水平。PaCO2在煙熏處理后24h內(nèi)呈升高趨勢，至24h達(dá)最高值(60.56±8.42mmHg)，此后逐漸降低，96h恢復(fù)至對照組水平。對照組COHb水平為0.60%±0.11%，建模組大鼠煙熏后1 h C O H b水平迅速增至11.22%±4.98% (P＜0.05)，煙熏后6h恢復(fù)至對照組水平，SO2%﹑O2Hb變化趨勢與COHb相反(表2)。

表2 各組大鼠煙霧吸入前后PaO2﹑PaCO2﹑SO2的變化(±s，n=6)Tab. 2 Changes of PaO2, PaCO2 and SO2 before and after smog inhalation (±s, n=6)

表2 各組大鼠煙霧吸入前后PaO2﹑PaCO2﹑SO2的變化(±s，n=6)Tab. 2 Changes of PaO2, PaCO2 and SO2 before and after smog inhalation (±s, n=6)

(1)P＜0.05 compared with NC group; (2)P＜0.05 compared with I-1h group; (3)P＜0.05 compared with I-2h group; (4)P＜0.05 compared with I-6h group; (5)P＜0.05 compared with I-24h group; (6)P＜0.05 compared with I-48h group

Group PaO2(mmHg) PaCO2(mmHg) SO2(%) COHb(%) O2Hb(%)NC group 83.27±4.99 42.42±3.27 91.45±3.43 0.60±0.11 90.90±3.40 I-1h group 47.79±13.28(1) 54.28±3.67(1) 67.82±16.30(1) 11.22±4.98(1) 60.29±15.51(1)I-2h group 51.67±10.11(1) 46.18±6.06(2) 72.53±9.90(1) 7.87±3.82(1) 69.23±10.48(1)I-6h group 64.10±12.61(1)(2)(3) 55.98±9.97(1)(2) 77.90±13.23 1.33±0.42 76.75±13.32(2)I-24h group 62.30±9.60(1)(2) 60.56±8.42(1)(2) 77.25±13.98 0.90±0.15 76.43±13.90(2)I-48h group 78.53±7.05(2)(3)(4)(5) 53.28±5.93(1) 90.63±5.12(2)(3) 0.90±0.17 89.83±5.04(2)(3)(5)I-96h group 65.00±11.21(1)(2)(3)(6) 48.30±2.01(5) 80.90±8.82 1.00±0.12 80.02±8.81(2)F value 10.318 5.327 3.923 18.792 6.464 P value ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.5 W/D及BALF白細(xì)胞計(jì)數(shù)﹑蛋白含量測定結(jié)果 煙霧吸入后1﹑2﹑6﹑96h時(shí)間點(diǎn)建模組大鼠W/D顯著高于對照組(P＜0.05)，并于2h時(shí)達(dá)最高值。各組BALF回收量均達(dá)80%以上，BALF中白細(xì)胞數(shù)自煙霧吸入后2h開始上升，至24h時(shí)達(dá)峰值，為(39.00±15.67)×105/ml，隨后降低。BALF中蛋白含量于煙霧吸入后1h達(dá)最高值，隨后逐漸下降，至48h恢復(fù)至對照組水平(表3)。

表3 肺W/D及BALF白細(xì)胞計(jì)數(shù)﹑總蛋白含量的變化(±s，n=6)Tab. 3 Changes of W/D, leukocytes and protein before and after smog inhalation (±s, n=6)

表3 肺W/D及BALF白細(xì)胞計(jì)數(shù)﹑總蛋白含量的變化(±s，n=6)Tab. 3 Changes of W/D, leukocytes and protein before and after smog inhalation (±s, n=6)

(1)P＜0.05 compared with NC group; (2)P＜0.05 compared with I-1h group; (3)P＜0.05 compared with I-2h group; (4)P＜0.05 compared with I-6h group; (5)P＜0.05 compared with I-24h group; (6)P＜0.05 compared with I-48h group

Group W/D WBC(×105/ml) Protein(mg/ml)NC group 4.22±0.43 3.85±1.93 0.25±0.03 I-1h group 4.98±0.44(1) 4.62±2.00 3.29±1.39(1)(2)I-2h group 5.37±0.49(1) 19.00±9.70(1)(2) 1.37±0.50(1)(2)I-6h group 4.89±0.15(1) 25.20±9.92(1)(2) 0.84±0.17(1)(2)I-24h group 4.61±0.26(2) 39.00±15.67(1)(2)(3)0.80±0.12(1)(2)(3)I-48h group 4.61±0.32(2) 16.20±7.46(2)(5) 0.51±0.17(2)(3)I-96h group 4.84±0.58(1)(2)(3)18.60±14.47(1)(2)(5)0.45±0.14(2)(3)F value 3.511 10.803 20.980 P value ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.6 肺組織病理觀察結(jié)果 肺組織大體觀：對照組大鼠肺組織顏色均勻，呈肉粉色，組織質(zhì)地柔軟，彈性好，未見腫脹﹑出血及壞死。建模組大鼠在吸入煙霧24h內(nèi)，肺組織正面及背面均明顯充血水腫，呈暗紅色，肺表面可見多處斑片狀出血，氣管腔內(nèi)含有乳白色泡沫，至吸入后96h可見肺組織恢復(fù)至淡紅色，肺葉邊緣出現(xiàn)斑片狀暗紅色梗死灶，彈性差(圖2)。光鏡下觀察：對照組大鼠肺泡腔結(jié)構(gòu)清晰﹑完整，腔內(nèi)無滲出液，肺泡間隔均勻一致；煙霧吸入1h后血管外即出現(xiàn)明顯出血﹑水腫，至6h可見毛細(xì)血管擴(kuò)張，肺泡腔內(nèi)可見透明膜及漏出紅細(xì)胞，24h后可見炎性細(xì)胞浸潤，48h后肺泡腔明顯增寬，肺泡間隔明顯增厚，炎性細(xì)胞浸潤增多，96h可見大量肺泡間隔斷裂，大量炎性細(xì)胞浸潤，以單核﹑巨噬細(xì)胞為主(圖3)。

3 討 論

既往研究構(gòu)建吸入性肺損傷模型所采用的發(fā)煙材料主要為煤油及干燥的松木屑，但這種方法產(chǎn)生的煙霧成分及燃燒方式與實(shí)戰(zhàn)環(huán)境差別較大[4-5]。本研究采用戰(zhàn)爭中常用的黑火藥，保證了燃燒材料的單一，既利于致傷因素分析，又能準(zhǔn)確模擬戰(zhàn)場環(huán)境。

圖2 肺組織大體觀Fig. 2 Gross examination of the rat lungs

圖3 肺組織病理學(xué)觀察(HE ×100)Fig. 3 Histopathological observation of the lung tissues (HE ×100)

本研究在火藥煙霧吸入毒理學(xué)分析平臺(tái)的基礎(chǔ)上進(jìn)行改裝，制作了適合建立動(dòng)物吸入性肺損傷模型的發(fā)煙裝置。裝置中煙霧在風(fēng)泵產(chǎn)生的氣流推動(dòng)下形成閉合回路，形成濃度分布均勻的煙霧環(huán)境。該裝置中發(fā)煙室與動(dòng)物煙熏室相互獨(dú)立，排除了火藥可能導(dǎo)致的燒傷﹑沖擊傷等復(fù)合致傷因素，保證了吸入性損傷為單一致傷因素。氣體濃度和溫度的檢測與監(jiān)控確保了構(gòu)建模型條件的一致性和可靠性。此外，本裝置在確保重復(fù)性和可靠性的條件下，體積小，組裝簡單，便于推廣應(yīng)用。本研究的不足之處是未能進(jìn)行煙霧成分中相關(guān)顆粒物的成分及粒徑檢測。

本研究分別改變火藥燃燒劑量和煙霧暴露時(shí)間，觀察大鼠在4d內(nèi)的生存情況，發(fā)現(xiàn)其死亡率隨火藥劑量增加及暴露時(shí)間延長而升高，與文獻(xiàn)報(bào)道趨勢一致[5-6]，但火藥劑量為11.0～12.5g時(shí)大鼠死亡率低于劑量為10g時(shí)，分析原因可能與動(dòng)物個(gè)體差異及數(shù)量較少有關(guān)。暴露時(shí)間為21min時(shí)，半數(shù)致死劑量在8～10g之間，取10g火藥燃燒，暴露10min時(shí)4d內(nèi)死亡率為40%，接近半數(shù)死亡率，而暴露8min時(shí)，4d內(nèi)未見動(dòng)物死亡，因此選擇10g火藥燃燒﹑暴露10min為致傷條件。

黑火藥燃燒原理為硝酸鉀分解放出的氧氣，使碳和硫劇烈燃燒，瞬間產(chǎn)生大量N2﹑CO2等氣體。本研究表明，在煙霧產(chǎn)生12min內(nèi)，CO2﹑CO﹑SO2﹑H2S氣體濃度及煙熏室中溫度均保持穩(wěn)定。CO2及CO濃度遠(yuǎn)高于空氣中的正常含量，CO是一種常見的窒息性毒物，同時(shí)有研究表明高濃度CO2也可能是導(dǎo)致肺部損傷的因素[7-8]。動(dòng)脈血?dú)夥治鼋Y(jié)果顯示大鼠在煙熏處理后即出現(xiàn)低氧血癥，隨后PaO2逐漸恢復(fù)，PaCO2先升高，至吸入后48h逐漸降低。COHb是由CO與血紅蛋白相結(jié)合而形成，可使血紅蛋白失去輸氧能力，肺部因缺氧致傷，其含量通常被認(rèn)為是判斷CO中毒的可靠指標(biāo)[9]。本研究大鼠動(dòng)脈血中COHb含量在煙霧吸入1h后即達(dá)到峰值，6h后恢復(fù)至正常水平，因此推測煙霧吸入后早期的低氧血癥可能是由大量吸入CO引起的。

W/D是評(píng)價(jià)肺水腫嚴(yán)重程度的良好指標(biāo)，而BALF中蛋白含量與肺微血管通透性呈正比[10]。本模型中，W/D和BALF蛋白含量在煙霧吸入后均迅速升高，提示大鼠經(jīng)煙霧刺激后肺部微血管通透性增加，并出現(xiàn)肺水腫。BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)是反映氣道及肺部炎癥的重要指標(biāo)，本研究結(jié)果顯示，煙霧暴露后大鼠BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)呈進(jìn)行性增加，至吸入后24h達(dá)峰值，96h仍未恢復(fù)至正常水平，與人類及其他動(dòng)物模型煙霧吸入后變化趨勢一致[6]，提示煙霧吸入可致肺局部炎癥細(xì)胞聚集，繼而活化并釋放相關(guān)炎性因子﹑氧自由基等，最終導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生。病理組織學(xué)觀察結(jié)果與上述指標(biāo)變化趨勢一致，至煙霧暴露后96h仍表現(xiàn)出典型的急性肺損傷的病理學(xué)特征。

綜上所述，采用本研究中的發(fā)煙裝置引燃10g火藥，并使大鼠在所產(chǎn)生的煙霧中暴露8min能夠成功構(gòu)建吸入性肺損傷大鼠模型，且在實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)相內(nèi)出現(xiàn)典型的急性肺損傷病理學(xué)特征，同時(shí)未見動(dòng)物因窒息而死亡。本模型的成功構(gòu)建為進(jìn)一步研究火藥煙霧所致吸入性肺損傷的發(fā)病機(jī)制及防治措施奠定了基礎(chǔ)。

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