中波紫外線誘導(dǎo)小鼠皮膚急性光損傷模型中ASC和caspase-1的表達(dá)

胡 堅(jiān)，楊閏平，李恒進(jìn)，趙 華

解放軍總醫(yī)院 皮膚科，北京 100853

急性光損傷是皮膚對(duì)日光中中波紫外線(ultraviolet B，UVB)產(chǎn)生的一種急性炎癥反應(yīng)，正常皮膚在單次過度照射UVB后即可引起這種局部炎癥反應(yīng)。急性光損傷的機(jī)制及防治一直是人們普遍關(guān)注的問題，研究認(rèn)為多種細(xì)胞因子參與了其發(fā)病過程。凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)屬于死亡結(jié)構(gòu)域超家族成員，由N端的熱蛋白結(jié)構(gòu)域(pyrindomain，PYD)和C端的caspase募集結(jié)構(gòu)域(caspase activation and recruitment domain，CARD)構(gòu)成，在肺、肝、結(jié)腸、卵巢、皮膚、眼、白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等組織和細(xì)胞表達(dá)，在先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡及調(diào)節(jié)趨化因子的活性、淋巴細(xì)胞的趨化性、抗原的攝取和呈遞等方面具有一定的意義[1-2]，而半胱氨酸蛋白酶caspase-1作為ASC的一種常見下游因子參與了ASC引起的多種生理及病理過程[3]。Watanabe和Feldmeyer等發(fā)現(xiàn)ASC和caspase-1在UVB照射后的人角質(zhì)形成細(xì)胞中表達(dá)增強(qiáng)，提示ASC和caspase-1可能參與了UVB所致急性光損傷的發(fā)病過程[4-5]。因此本實(shí)驗(yàn)通過觀察ASC和caspase-1在UVB誘導(dǎo)的急性光損傷皮損中的表達(dá)，探討其在急性光損傷發(fā)病中的可能機(jī)制。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠共30只，6~8周齡，體質(zhì)量18~20 g。小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(許可證編號(hào)：SCXK(京)2011-0004)，飼養(yǎng)于解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

2 試劑和儀器 小鼠ASC、caspase-1單克隆抗體，Abcam公司；UVB燈管(TL20W/12RS)， PHLIPS公司。

3 小鼠急性光損傷模型的建立 輻照計(jì)測(cè)定UVB燈管波長(zhǎng)為280~320 nm，距離燈管20 cm處輻照強(qiáng)度為0.33 mW/cm2。固定照射距離為20 cm，根據(jù)輻射時(shí)間(s)=所需照射劑量(mJ/cm2)/輻照強(qiáng)度(mW/cm2)確定輻照時(shí)間。預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定MED：將10只小鼠分為5組，每組2只，參考國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)[6-7]，分別對(duì)耳部照射30、90、150、300、600 mJ/cm2劑量的UVB，測(cè)得MED約為90 mJ/cm2。觀察不同劑量UVB照射小鼠耳部臨床和組織病理表現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組鼠耳采用4倍MED即360 mJ/cm2劑量給予單次照射，表現(xiàn)與急性光損傷的表現(xiàn)一致[8-9]。實(shí)驗(yàn)組操作如下：預(yù)熱UVB燈管5 min，將小鼠固定于工作臺(tái)上。小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組10只，對(duì)照組不照射UVB，實(shí)驗(yàn)組照射4倍MED劑量UVB。觀察實(shí)驗(yàn)組的光損傷變化，于照射后24 h取小鼠耳。

4 免疫組化檢測(cè)皮膚ASC和caspase-1 分別取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠耳， 4%甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。采用Elivision法，2 μm厚度連續(xù)切片，高壓鍋加熱修復(fù)，雙氧水消除過氧化酶。分別滴加1∶100 ASC和1∶100 caspase-1一抗，4 ℃濕盒過夜后PBS洗3次，每次3 min，滴加二抗，室溫靜置20 min后PBS洗3次，再加三抗，靜置20 min，PBS洗3次。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、中性樹膠封片。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

5 結(jié)果判定 由兩名醫(yī)生對(duì)免疫組化染色切片進(jìn)行評(píng)估。在顯微鏡下觀察表皮細(xì)胞著色情況，每張陽性切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(×400)，各計(jì)數(shù)100個(gè)角質(zhì)形成細(xì)胞中陽性細(xì)胞所占的百分比，根據(jù)陽性細(xì)胞比例，無陽性染色為0分、0~25%為1分、26%~50%為2分、51%~75%為3分、≥76%為4分；并按染色強(qiáng)度無、弱、中、強(qiáng)分別計(jì)為0~3分。綜合兩個(gè)指標(biāo)將評(píng)分分為4級(jí)，0分為陰性、1~3分為弱陽性、4~5分為陽性、6~7分為強(qiáng)陽性。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，兩獨(dú)立樣本非正態(tài)分布定量資料采用Wilconxon秩和檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 左側(cè)為對(duì)照組小鼠，右側(cè)為實(shí)驗(yàn)組小鼠Fig.1 Mice in the blank control group (left)and experimental group (right)

圖2 小鼠急性光損傷模型(HE×100) 對(duì)照組(左)；實(shí)驗(yàn)組(右)Fig.2 UVB-induced light injury model in blank control group (left)and experimental group (right)(HE×100)

圖3 ASC在小鼠耳部皮膚的表達(dá) 對(duì)照組(左)；實(shí)驗(yàn)組(右)Fig.3 Immunohistochemical staining showing expressions of ASC-like protein in blank control group (left) and experimental group (right)

圖4 caspase-1在小鼠耳部皮膚的表達(dá) 對(duì)照組(左)；實(shí)驗(yàn)組(右)Fig.4 Immunohistochemical staining showing expressions of caspase-1 in blank control group(left) and experimental group (right)

結(jié) 果

1 小鼠皮膚急性光損傷模型 與對(duì)照組相比，4倍MED劑量UVB照射的實(shí)驗(yàn)組小鼠24 h后耳部皮膚水腫、增厚，出現(xiàn)紅斑、毛細(xì)血管擴(kuò)張。見圖1。組織病理改變，HE染色顯示表皮細(xì)胞增生、水腫、部分細(xì)胞空泡形成、核固縮，真皮乳頭淺層水腫、血管擴(kuò)張、管周淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖2。臨床表現(xiàn)和組織病理均符合急性光損傷表現(xiàn)。

2 免疫組化結(jié)果 1)ASC在小鼠耳部表皮的表達(dá)：對(duì)照組小鼠耳部表皮部分細(xì)胞胞漿和胞核染為淺棕黃色，染色評(píng)分中位數(shù)為1.23；照射4倍MED的實(shí)驗(yàn)組鼠耳部表皮細(xì)胞水腫，排列紊亂，表皮全層細(xì)胞胞漿和胞核染為深棕黃色，ASC表達(dá)增強(qiáng)，染色評(píng)分中位數(shù)為4.11，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=65.0，P＜ 0.01)。見圖 3。2)caspase-1在小鼠耳部表皮的表達(dá)：對(duì)照組小鼠耳部表皮部分細(xì)胞胞漿和胞核染為淺棕黃色，染色評(píng)分中位數(shù)為1.16；照射4倍MED的實(shí)驗(yàn)組鼠耳部表皮細(xì)胞水腫，排列紊亂，染為棕黃色，且陽性染色細(xì)胞增多，caspase-1表達(dá)增強(qiáng)，染色評(píng)分中位數(shù)為1.59，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=56.5，P＜0.01)。見圖4。

討 論

國(guó)內(nèi)外雖不乏關(guān)于急性光損傷的研究，但目前尚未形成統(tǒng)一的動(dòng)物模型，不同模型的差異主要表現(xiàn)在：1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：國(guó)外最多采用SKH-1無毛小鼠，其優(yōu)點(diǎn)在于皮膚裸露便于照射，且具有胸腺，免疫功能正常[6]。而國(guó)內(nèi)多采用Balb/C小鼠剃毛后照射UVB[7]。2)照射部位：因小鼠背部體表面積較大，實(shí)驗(yàn)多對(duì)背部進(jìn)行照射。3)光源：采用日光模擬器或紫外熒光燈，UVB波長(zhǎng)約為290~320 nm。4)UVB照射方法：國(guó)外SKH-1小鼠多采用UVB單次照射，劑量為 200、360、800 mJ/cm2不等[6]；Sumiyoshi等對(duì)C57BL/6J小鼠進(jìn)行UVB 120 mJ/cm2(約為3.3MED)照射[8]。而國(guó)內(nèi)多對(duì)Balb/C小鼠進(jìn)行180 mJ/cm2單次或多次照射[7]。5)評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：以臨床表現(xiàn)為紅斑、水腫；組織病理表現(xiàn)為表皮細(xì)胞水腫、空泡形成、核固縮，表皮內(nèi)或表皮下水皰形成，真皮血管擴(kuò)張等為急性光損傷特征[6,8]。本實(shí)驗(yàn)采用UVB單次照射Balb/C小鼠，選取毛發(fā)較少的耳部皮膚，借鑒國(guó)內(nèi)外經(jīng)驗(yàn)，并根據(jù)測(cè)定的MED以及觀察劑量的小鼠耳部紅斑反應(yīng)，確定采用4倍MED劑量，臨床及組織病理表現(xiàn)與急性光損傷基本符合，認(rèn)為造模成功。

以往研究認(rèn)為，UVB引起的急性光損傷主要表現(xiàn)為急性炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡兩個(gè)方面。1)急性炎癥反應(yīng)：UVB照射后誘導(dǎo)生成的ROS作為第二信使通過p38MAPK、ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活轉(zhuǎn)錄因子c-Jun、c-Fos、NF-kB，誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞生成前炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α，促進(jìn)角質(zhì)形成、細(xì)胞增殖及中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等的浸潤(rùn)；UVB還可激活環(huán)氧合酶COX-2，進(jìn)一步誘導(dǎo)合成PGE2、VEGF、MMPs、ICAM-1、PECAM-1等，促進(jìn)炎癥反應(yīng)及血管生成。2)細(xì)胞凋亡：DNA可直接吸收UVB，在相鄰嘧啶堿基之間形成二聚體光產(chǎn)物。此外，UVB誘導(dǎo)生成過量的活性氧及氮簇，超過了機(jī)體的清除能力，引起多種形式的DNA損傷如單鏈斷裂、鏈間交聯(lián)、堿基修飾等。

研究顯示，ASC可通過多種途徑發(fā)揮生物學(xué)作用[2-3]：1)參與形成NLRP3炎癥小體以參與炎癥反應(yīng)。2)通過寡聚形成超分子結(jié)構(gòu)即焦亡小體調(diào)節(jié)細(xì)胞焦亡。3)參與細(xì)胞凋亡過程。在UVB引起的急性光損傷中，一方面低劑量UVB誘導(dǎo)產(chǎn)生大量ROS，并使細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高，ROS和Ca2+作為危險(xiǎn)因子促使ASC參與形成NALP3炎癥小體。ASC作為接頭蛋白連接前caspase-1，使caspase-1自分裂、活化，并進(jìn)一步促使前IL-1β和前IL-18裂解成為活性IL-1β和IL-18，誘導(dǎo)其他炎癥細(xì)胞因子如IL-6、趨化因子、黏附分子等的合成，放大局部炎癥反應(yīng)[9]。另一方面，UVB也可能通過ROS增強(qiáng)ASC的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡。焦亡是新近發(fā)現(xiàn)的一種新的由caspase-1介導(dǎo)的伴有大量炎癥因子釋放的細(xì)胞程序性死亡方式，ASC寡聚形成超分子功能性復(fù)合體通過caspase-1促使DNA的降解，并可導(dǎo)致細(xì)胞膜的完整性喪失，從而使胞內(nèi)容物釋放，加重炎癥反應(yīng)[2]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)4倍MED的UVB照射后，實(shí)驗(yàn)組小鼠耳部表皮細(xì)胞ASC和caspase-1表達(dá)較對(duì)照組增強(qiáng)，提示ASC和caspase-1參與了小鼠急性光損傷的發(fā)病過程，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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