• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    中國(guó)南海多棘海星水提物抗皮膚真菌的活性分析

    2013-08-27 03:24:56唐曉磊陳章權(quán)于靜蕊
    關(guān)鍵詞:海星水提物葡聚糖

    華 影,唐曉磊,陳章權(quán),于靜蕊

    1遼寧醫(yī)學(xué)院,遼寧錦州 121001;2武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,湖北武漢 430071;3廣東醫(yī)學(xué)院廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東東莞 523808;4遼寧錦州市中心醫(yī)院,遼寧錦州 121001;5阜陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,安徽阜陽(yáng) 236031

    海星(sea star)是常見的海洋生物之一。近年來(lái)已發(fā)現(xiàn)多種海星活性物質(zhì),如皂苷、甾醇、蒽醌、多糖、多肽、糖脂等,具有抗腫瘤、抗感染、抗心管病等作用[1-5]。課題組此前曾報(bào)道過(guò)南海多棘海星的提取物在NKT細(xì)胞激活以及抗腫瘤方面的研究工作[6-7]。國(guó)內(nèi)對(duì)海星抗真菌的研究?jī)H見膠州灣羅氏海星皂苷類物質(zhì)抗酵母真菌的報(bào)道[8],而海星抗皮膚真菌卻鮮有報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)做了對(duì)我國(guó)南海多棘海星提取物抗皮膚真菌的研究,報(bào)告如下。

    材料和方法

    1 材料 多棘海星(asteruzs rollestoni)采自中國(guó)湛江海域,由海南大學(xué)海洋學(xué)院方再光博士鑒定。紅色毛癬菌(tricophyton rubrum)5株,斷發(fā)毛癬菌(trichophyton tonsurans)和石膏樣小孢子菌(microsprum gypseum)各3株,由遼寧錦州市中心醫(yī)院皮膚科實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng);馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(potato dextrose agar,PDA)購(gòu)于青島海博生物技術(shù)有限公司;冷凍干燥機(jī)77520-01 Freezone b購(gòu)自美國(guó)(Labconco公司);Milli-Q超純水機(jī);貝克曼-庫(kù)爾特波長(zhǎng)掃描儀;96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar);Bio-Rad TC-10細(xì)胞計(jì)數(shù)儀;Eppendorf培養(yǎng)箱;Agilent 1260型高效液相柱層析(HPLC)儀,Agilent ZORBAX GF-250型葡聚糖凝膠色譜柱(9.4 mm×250 mm,4 μm)和ZORBAX 300 Extend C18硅膠色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)均為美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品,HPLC層析柱洗脫流動(dòng)相所用甲醇、乙腈為色譜純,氟康唑(fluconazole)常州市第二制藥廠,批號(hào)930805。其余試劑均為國(guó)藥集團(tuán)分析純。

    2 海星水溶性成分的制備 取新鮮南海多棘海星,經(jīng)粉碎、冷凍干燥、除脂等處理[6-7],加入2倍體積的去離子水,于4 ℃環(huán)境中連續(xù)攪拌24 h,400目紗布過(guò)濾后收集海星水提液,10 000 g離心10 min,將水相提取液pH調(diào)整為7.4,并于-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

    3 海星水提物特征吸收波長(zhǎng)的確定 將提取的儲(chǔ)存液配制成3個(gè)濃度梯度,并以貝克曼波長(zhǎng)掃描儀從190~900 nm進(jìn)行連續(xù)掃描,對(duì)海星水提物中在某特定波長(zhǎng)處有吸收峰的波長(zhǎng)作為后續(xù)分離的檢測(cè)波長(zhǎng)。

    4 高效液相色譜法(HPLC)對(duì)水提物的分離 將水提物經(jīng)過(guò)高效液相色譜儀(HPLC)連以葡聚糖凝膠柱ZORBAX GF-250分離手段進(jìn)行初步分離,以pH 7.4的磷酸鹽緩沖液為流動(dòng)相,調(diào)節(jié)柱溫箱為23 ℃,流速為1 ml/min,在213 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)。隨后利用高效液相色譜儀(HPLC)連以C18硅膠柱對(duì)首次分離的有效組分進(jìn)一步分離。在ZORBAX 300 Extend C18硅膠色譜柱中以V水∶V乙腈∶V甲醇=60∶20∶20為流動(dòng)相,調(diào)節(jié)柱溫箱為23 ℃,流速為1 ml/min,在213 nm處進(jìn)行檢測(cè)。

    5 抗真菌的活性檢測(cè) 配制新鮮產(chǎn)孢子液體培養(yǎng)基:含L-谷酰胺而不含重碳酸鹽的RPMI1640培養(yǎng)基,使用0.165 mol/L 3-(N-嗎啡啉)丙磺酸調(diào)至pH 7.0,0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌備用。初次分離的冷凍干燥后,稱取并用新鮮的液體培養(yǎng)基調(diào)至0.1 mg/ml備用。將26 ℃培養(yǎng)10 d后的PDA培養(yǎng)基中注入含0.05%吐溫-80 ℃的0.9%氯化鈉無(wú)菌溶液,適度震蕩并用無(wú)菌玻棒摩擦菌落表面,用200目濾網(wǎng)除去菌絲,用Bio-Rad細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù),最終以配制的含有不同分離組分的液體培養(yǎng)基調(diào)孢子濃度至105/ml備用。設(shè)置空白對(duì)照(僅含有培養(yǎng)基)、氟康唑陽(yáng)性對(duì)照組(氟康唑用少許二甲基亞砜助溶終濃度為10 μg/ml)、陰性對(duì)照和各提取組分實(shí)驗(yàn)組,每組同時(shí)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將培養(yǎng)板置于30 ℃,濕度80%~90% RH的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)96 h后,重新計(jì)數(shù)各培養(yǎng)孔中的孢子濃度。并計(jì)算孢子生長(zhǎng)率:(提取物實(shí)驗(yàn)組待測(cè)孔讀數(shù)-空白孔孢子讀數(shù)/陰性孔讀數(shù)-空白孔讀數(shù))×100%。在隨后對(duì)初次分離第3組分(FSF-3)抑制紅色毛癬菌的檢測(cè)中,用新鮮液體培養(yǎng)基將初次分離第3組分配制成終濃度分別為100 μg/ml、50 μg/ml、25 μg/ml、12.5 μg/ml、6.25 μg/ml、3.12 μg/ml、1.56 μg/ml、0.78 μg/ml、0.39 μg/ml, 其 余 組 別設(shè)置及操作同上。FSF-3經(jīng)高效液相色譜連以C18硅膠柱分離各組分冷凍干燥后,稱量各組分并以新鮮液體培養(yǎng)基(上述)調(diào)至10 μg/ml、5 μg/ml、1 μg/ml進(jìn)行抗菌檢測(cè)。其余組別設(shè)置及操作同上。

    結(jié) 果

    1 海星水提取物的波長(zhǎng)掃描圖譜 將水提物配制成1 mg/ml、0.5 mg/ml、0.1 mg/ml 3個(gè)濃度,在190~900 nm每間隔1nm進(jìn)行連續(xù)掃描,測(cè)得各波長(zhǎng)的吸光度值,發(fā)現(xiàn)在213 nm處有峰值,見圖1。

    2 海星水提取物經(jīng)葡聚糖凝膠柱分離圖譜 在葡聚糖凝膠柱中以pH 7.4的磷酸鹽為流動(dòng)相,調(diào)節(jié)柱溫箱為23 ℃,調(diào)節(jié)流速至1 ml/min,在213 nm處檢測(cè),對(duì)海星水提取物各分離組分的響應(yīng)度所繪制的峰圖,根據(jù)分離程度結(jié)合實(shí)驗(yàn)需要分為5組主要成分,分別標(biāo)記為FSF-1、FSF-2、FSF-3、FSF-4、FSF-5,見圖 2。

    3 葡聚糖凝膠柱分離所得各組分抗真菌活性鑒定使用微孔稀釋法通過(guò)對(duì)96 h培養(yǎng)后各孔孢子濃度的測(cè)定,在同一菌種的藥物敏感性檢測(cè)中以(待測(cè)孔讀數(shù)-空白孔孢子讀數(shù)/陰性孔讀數(shù)-空白孔讀數(shù))×100%表示其孢子生長(zhǎng)率(表1),以及FSF-3組分抑制紅色毛癬菌的劑量依賴性的檢測(cè),結(jié)果顯示隨著FSF-3濃度的降低抑菌效果逐漸減弱,當(dāng)濃度低于0.78 μg/ml則無(wú)明顯抑菌效果,見圖3。

    4 FSF-3組分分離圖譜 以V水∶V乙腈∶V甲醇=60∶20∶20為流動(dòng)相,并以流動(dòng)相溶解FSF-3至濃度為1 mg/ml,調(diào)節(jié)柱溫箱為23℃,調(diào)節(jié)流速至1 ml/min,通過(guò)C18硅膠柱按照極性差異,在213 nm處進(jìn)行分離。根據(jù)分離情況分為3個(gè)主要組分,分別標(biāo)記為SSF-1、SSF-2、SSF-3,見圖4。

    5 FSF-3再次分離所得各組分抗真菌活性鑒定微量稀釋法檢測(cè)不同濃度SSF-1、SSF-2、SSF-3組分對(duì)紅色毛癬菌的抑制作用,見表2。

    圖1 三種濃度海星水提取物的波長(zhǎng)掃描Fig.1 Wavelength scan of water-soluble extracts from Asteruzs rollestoni at 3 different concentrations

    圖2 海星水提取物在葡聚糖凝膠分離柱中的色譜圖FSF1-FSF5: 第一分離組分至第五分離組分Fig.2 Chromatogram of water-soluble extract from Asteruzs rollestoni by sephadex column FSF1-FSF5: The first separated fractions 1-5

    圖3 不同濃度海星水提物組分FSF-3對(duì)紅色毛癬菌孢子生長(zhǎng)率的影響Fig.3 Effect of FSF-3 at different concentrations separated from Asteruzs rollestoni on growth rate of Tricophyton rubrum spore

    圖4 海星水提物FSF-3組分經(jīng)C18硅膠分離柱分離組分的色譜圖Fig.4 Chromatogram of FSF-3 separated by combined HPLC and C18 silicagel column SSF-1-3: secondary separated fractions 1-3

    表1 葡聚糖凝膠柱分離各組分對(duì)三種真菌孢子生長(zhǎng)率的影響Tab.1 Effect of every components from the separation of sephadex column on the growth rate of three kinds of fungal spore (n=3,%)

    表1 葡聚糖凝膠柱分離各組分對(duì)三種真菌孢子生長(zhǎng)率的影響Tab.1 Effect of every components from the separation of sephadex column on the growth rate of three kinds of fungal spore (n=3,%)

    ?

    表2 FSF-3經(jīng)C18硅膠分離柱分離所得三個(gè)組分對(duì)紅色毛癬菌孢子生長(zhǎng)率的影響Tab.2 Effect of 3 components separaed by C18 silicagel column on growth rate of Tricophyton rubrum spore (n=3, %)

    表2 FSF-3經(jīng)C18硅膠分離柱分離所得三個(gè)組分對(duì)紅色毛癬菌孢子生長(zhǎng)率的影響Tab.2 Effect of 3 components separaed by C18 silicagel column on growth rate of Tricophyton rubrum spore (n=3, %)

    ?

    討 論

    皮膚癬菌引起的淺部真菌感染一直是皮膚科臨床最常見的皮膚病[9]。目前臨床上使用的各種合成抗真菌藥物在一定程度上可以控制真菌的感染,然而其對(duì)人體均有一定的不良反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)首次對(duì)中國(guó)南海海域的多棘海星其體內(nèi)水溶性物質(zhì)的抗真菌活性展開研究,對(duì)海星水溶性物質(zhì)進(jìn)行分離并與常見的3種皮膚癬菌共培養(yǎng)進(jìn)行抑菌活性檢測(cè),旨在從中篩選出具有抗菌活性的成分。

    本研究在對(duì)提取物各組分的抑菌活性檢測(cè)中使用了微量稀釋法,該方法優(yōu)點(diǎn)是用藥量少,操作易標(biāo)準(zhǔn)化及可借助儀器判讀結(jié)果等。該技術(shù)已被推薦用于酵母菌的MIC測(cè)定,室間質(zhì)控結(jié)果證明效果滿意[10]。中國(guó)醫(yī)科院皮膚病研究所于1997年首次報(bào)道了微量稀釋法在測(cè)定皮膚癬菌最低抑菌濃度的實(shí)驗(yàn)研究[11]。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),此液體培養(yǎng)基的應(yīng)用可有效的產(chǎn)生豐富的真菌孢子而只有極少量的菌絲以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

    本文先將海星水溶性成分通過(guò)葡聚糖凝膠柱,根據(jù)分子量大小進(jìn)行初次分離。將初次分離的組分與3種真菌共培養(yǎng)的結(jié)果顯示,在初次分離的FSF-3組分中含有對(duì)紅色毛癬菌有較強(qiáng)抑菌作用的物質(zhì)。紅色毛癬菌是臨床常見的皮膚癬菌,皮膚淺部真菌病60%以上是由紅色毛癬菌感染所致[9,12]。遂將FSF-3組分作為重點(diǎn)研究對(duì)象,追蹤具有抑菌活性的成分。對(duì)FSF-3的分離中使用了HPLC連接C18硅膠柱根據(jù)極性差異進(jìn)行再次分離,經(jīng)過(guò)物質(zhì)分子量和極性的兩次分離,這樣保證了物質(zhì)成分較為單純。對(duì)各分離組分的抑菌活性檢測(cè)中發(fā)現(xiàn),F(xiàn)SF-3組分的MIC(middle inhibitor concentration)可達(dá)3.15 μg/ml,與同類提取物對(duì)紅色毛癬菌的抑菌濃度報(bào)道相比,其濃度顯著低于報(bào)道值[13-14]。而對(duì)FSF-3的進(jìn)一步分離檢測(cè)發(fā)現(xiàn),SSF-1組分對(duì)紅色毛癬菌的抑菌活性不明顯,而SSF-2及SSF-3對(duì)紅色毛癬菌均有一定的抑菌效果。推測(cè)SSF-2和SSF-3中可能存在著分子量大小接近而極性卻差異較為明顯的物質(zhì)。然而對(duì)該活性組分的物質(zhì)結(jié)構(gòu)、性質(zhì)等信息仍需進(jìn)一步的鑒定,并擬在動(dòng)物水平上驗(yàn)證其抗菌活性。上述研究為研制新型的海洋抗真菌藥物提供了方向和切入點(diǎn)。

    1 李婷菲,葉斌.藥用海洋活性物質(zhì)的研究進(jìn)展[J].海峽藥學(xué),2009,21(11):12-14.

    2 卞?。畤?guó)內(nèi)外海洋藥物研究進(jìn)展和展望[J].海軍醫(yī)學(xué)雜志,2007,28(1):84-87.

    3 湯海峰, 易楊華, 張淑瑜, 等. 海星皂苷的研究進(jìn)展[J].中國(guó)海洋藥物,2004,23(6):48-57.

    4 劉鐵錚,郭愛潔,王桂春,等.海星化學(xué)成分的生物活性及應(yīng)用研究進(jìn)展[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,38(13):122-125.

    5 Peng Y, Zheng J, Huang R, et al. Polyhydroxy steroids and saponins from China Sea starfish Asterina pectinifera and their biological activities[J]. Chem Pharm Bull (Tokyo), 2010, 58(6):856-858.

    6 何素輝, 唐曉磊, 鄧亦峰,等.多棘海星乙醇提取物對(duì)小鼠血清IL-4和IFN-γ水平的影響[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2011,27(11):1198-1200.

    7 何素輝,唐曉磊,侯玉濤,等.南中國(guó)多棘海星乙醇提取物體外抗腫瘤活性作用的初步研究[J].分子診斷與治療雜志,2011,3(6):402-405.

    8 樊廷俊,張錚,袁文鵬,等.水溶性海星皂苷的分離純化及其抗真菌活性研究[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào):理學(xué)版,2008,43(9):1-5.

    9 張道軍,黃云麗,張衛(wèi)衛(wèi),等.淺部真菌病2600例病原菌分析[J].中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志,2012,26(6):501-503.

    10 Shawar R, Paetznick V, Witte Z, et al. Collaborative investigation of broth microdilution and semisolid agar dilution for in vitro susceptibility testing of Candida albicans[J]. J Clin Microbiol,1992, 30(8):1976-1981.

    11 劉維達(dá),王金燕,吳建明.微量稀釋法測(cè)定皮膚癬菌最低抑菌濃度(MIC)的實(shí)驗(yàn)研究[J].臨床皮膚科雜志,1997(4):17-19.

    12 Mukherjee PK, Leidich SD, Isham N, et al. Clinical Trichophyton rubrum strain exhibiting primary resistance to terbinafine[J].Antimicrob Agents Chemother, 2003, 47(1):82-86.

    13 安惠霞,李治建,古力娜·達(dá)吾提,等.地錦草提取物對(duì)紅色毛癬菌酶活性的影響[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2010,21(4):787-788.

    14 李永軍,張瑞,王鑫,等.白藜蘆醇對(duì)皮膚癬菌抗菌活性的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué),2011,14(8):892-893.

    猜你喜歡
    海星水提物葡聚糖
    神奇的海星
    鬼針草水提物對(duì)大鼠腎結(jié)石改善作用
    中成藥(2021年5期)2021-07-21 08:39:02
    追夢(mèng)小海星
    海星
    文苑(2019年14期)2019-08-09 02:14:04
    天麻水提物HPLC指紋圖譜的建立及其真?zhèn)舞b別
    中成藥(2018年12期)2018-12-29 12:25:38
    枇杷葉水提物的急性毒性和遺傳毒性
    葡聚糖類抗病誘導(dǎo)劑在水稻上的試驗(yàn)初報(bào)
    海星有血嗎?
    丹參水提物對(duì)缺血—再灌注心律失常大鼠的保護(hù)作用及機(jī)制
    小麥麩皮中β-葡聚糖的分離純化及組成研究
    久久九九热精品免费| 欧美黄色淫秽网站| 在线永久观看黄色视频| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 搞女人的毛片| 91麻豆av在线| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | av在线天堂中文字幕| 此物有八面人人有两片| 黑人操中国人逼视频| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国内精品久久久久久久电影| 国产亚洲av嫩草精品影院| 日韩欧美三级三区| 此物有八面人人有两片| 三级毛片av免费| 一区福利在线观看| 欧美日韩瑟瑟在线播放| www.精华液| 三级毛片av免费| 国产亚洲精品久久久久5区| 在线免费观看的www视频| 美女免费视频网站| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国语自产精品视频在线第100页| 精品国内亚洲2022精品成人| 亚洲成a人片在线一区二区| 午夜福利在线观看吧| 我要搜黄色片| 九九热线精品视视频播放| 国产91精品成人一区二区三区| 啦啦啦免费观看视频1| 91字幕亚洲| 日韩欧美 国产精品| 白带黄色成豆腐渣| 俄罗斯特黄特色一大片| 91麻豆av在线| 久久中文字幕人妻熟女| 久久99热这里只有精品18| 脱女人内裤的视频| 亚洲成av人片免费观看| 欧美zozozo另类| 亚洲欧美一区二区三区黑人| avwww免费| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 曰老女人黄片| 美女扒开内裤让男人捅视频| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲成人中文字幕在线播放| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产成人影院久久av| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 又爽又黄无遮挡网站| 亚洲国产精品成人综合色| 亚洲美女视频黄频| 久热爱精品视频在线9| 成年免费大片在线观看| 男女视频在线观看网站免费 | 18禁黄网站禁片午夜丰满| a在线观看视频网站| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 国产精品一区二区三区四区久久| 亚洲真实伦在线观看| 国产一级毛片七仙女欲春2| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 黄色毛片三级朝国网站| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 禁无遮挡网站| 国产不卡一卡二| 亚洲国产精品合色在线| 天天一区二区日本电影三级| 级片在线观看| 国产单亲对白刺激| xxxwww97欧美| 中亚洲国语对白在线视频| 一夜夜www| 欧美日韩乱码在线| 精品免费久久久久久久清纯| 国产一区二区激情短视频| 十八禁网站免费在线| 国产主播在线观看一区二区| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 最好的美女福利视频网| 国产精品影院久久| 婷婷精品国产亚洲av在线| 两个人的视频大全免费| 一区二区三区国产精品乱码| 久久伊人香网站| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 大型av网站在线播放| 免费观看人在逋| 免费看美女性在线毛片视频| 久久香蕉国产精品| 欧美黑人精品巨大| 美女大奶头视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 999精品在线视频| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 成人永久免费在线观看视频| 99久久99久久久精品蜜桃| 欧美高清成人免费视频www| 一区二区三区国产精品乱码| 一级毛片高清免费大全| 国产成+人综合+亚洲专区| 日韩精品中文字幕看吧| 国产精品免费视频内射| 欧美一级毛片孕妇| 免费在线观看日本一区| 久久 成人 亚洲| 激情在线观看视频在线高清| 三级国产精品欧美在线观看 | 伦理电影免费视频| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 又大又爽又粗| 日本 欧美在线| 欧美在线黄色| 国产av在哪里看| 成人永久免费在线观看视频| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲人与动物交配视频| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 在线观看日韩欧美| 桃红色精品国产亚洲av| 久久精品91无色码中文字幕| 欧美成人性av电影在线观看| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 99在线人妻在线中文字幕| 国产精品一及| 变态另类丝袜制服| 久久久久久大精品| 亚洲18禁久久av| 久久精品综合一区二区三区| 亚洲中文av在线| 国产精品爽爽va在线观看网站| 叶爱在线成人免费视频播放| 亚洲国产精品sss在线观看| 婷婷精品国产亚洲av| 久久午夜综合久久蜜桃| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产91精品成人一区二区三区| 91麻豆精品激情在线观看国产| 欧美黑人精品巨大| 成人三级黄色视频| 免费av毛片视频| 国产av一区二区精品久久| 丁香欧美五月| 日韩欧美国产一区二区入口| 91字幕亚洲| 人人妻人人澡欧美一区二区| 一区二区三区高清视频在线| 国产精品1区2区在线观看.| 日韩中文字幕欧美一区二区| 久久这里只有精品19| 欧美三级亚洲精品| 美女大奶头视频| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 国产私拍福利视频在线观看| 久久香蕉国产精品| 亚洲七黄色美女视频| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 三级国产精品欧美在线观看 | 免费在线观看日本一区| 免费观看精品视频网站| 精品久久久久久久久久久久久| 婷婷丁香在线五月| 久9热在线精品视频| 高清毛片免费观看视频网站| 精华霜和精华液先用哪个| 男女下面进入的视频免费午夜| 男女床上黄色一级片免费看| 欧美黑人欧美精品刺激| 午夜影院日韩av| 99久久精品热视频| 亚洲成人国产一区在线观看| 久久精品综合一区二区三区| 一级片免费观看大全| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 国产麻豆成人av免费视频| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 中文字幕最新亚洲高清| 欧美性长视频在线观看| 午夜两性在线视频| 亚洲 国产 在线| 少妇被粗大的猛进出69影院| 长腿黑丝高跟| а√天堂www在线а√下载| www.www免费av| e午夜精品久久久久久久| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 日韩大尺度精品在线看网址| 91在线观看av| 毛片女人毛片| 日本一区二区免费在线视频| 后天国语完整版免费观看| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 久久香蕉精品热| 久久久精品大字幕| 欧美日韩国产亚洲二区| 亚洲av成人精品一区久久| 国产精品电影一区二区三区| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 高潮久久久久久久久久久不卡| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 日本黄大片高清| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 亚洲片人在线观看| www.999成人在线观看| 国产精品av久久久久免费| www.www免费av| 午夜老司机福利片| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产av麻豆久久久久久久| 在线a可以看的网站| 一区二区三区高清视频在线| 国产精品影院久久| 免费在线观看成人毛片| 亚洲avbb在线观看| bbb黄色大片| 少妇的丰满在线观看| 法律面前人人平等表现在哪些方面| xxxwww97欧美| 99久久综合精品五月天人人| 桃色一区二区三区在线观看| 变态另类丝袜制服| 成人18禁在线播放| 母亲3免费完整高清在线观看| 亚洲熟妇熟女久久| 亚洲乱码一区二区免费版| 日本黄大片高清| 成人永久免费在线观看视频| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 午夜免费激情av| 久久人人精品亚洲av| 18禁美女被吸乳视频| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 全区人妻精品视频| 1024手机看黄色片| 国产精品久久久久久精品电影| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 午夜免费观看网址| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 成人三级黄色视频| 妹子高潮喷水视频| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产真实乱freesex| 美女扒开内裤让男人捅视频| 欧美日本视频| 黄色毛片三级朝国网站| 国产黄片美女视频| 亚洲中文字幕日韩| 国产亚洲精品第一综合不卡| 哪里可以看免费的av片| 91国产中文字幕| 国产高清videossex| 怎么达到女性高潮| 老司机深夜福利视频在线观看| 亚洲人成网站高清观看| 人人妻人人看人人澡| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 欧美在线黄色| 91成年电影在线观看| 一级作爱视频免费观看| 成年免费大片在线观看| 成熟少妇高潮喷水视频| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 天堂影院成人在线观看| 观看免费一级毛片| 可以在线观看毛片的网站| 精品不卡国产一区二区三区| 搡老岳熟女国产| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| cao死你这个sao货| 午夜福利视频1000在线观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 色综合婷婷激情| 国产精品99久久99久久久不卡| 午夜视频精品福利| 午夜福利欧美成人| 亚洲熟妇熟女久久| 在线观看午夜福利视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 久久久精品大字幕| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 91字幕亚洲| 丰满人妻一区二区三区视频av | 久久久久久大精品| 国产成人av教育| 美女扒开内裤让男人捅视频| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 精品乱码久久久久久99久播| 我要搜黄色片| 1024手机看黄色片| 欧美中文综合在线视频| 99热这里只有是精品50| 色老头精品视频在线观看| 日本黄大片高清| 亚洲精品色激情综合| 欧美黑人巨大hd| 婷婷丁香在线五月| 久久久久免费精品人妻一区二区| 两个人的视频大全免费| 国产精品一区二区三区四区久久| 毛片女人毛片| 九色国产91popny在线| 亚洲熟女毛片儿| 两个人免费观看高清视频| 亚洲av电影在线进入| 禁无遮挡网站| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 色尼玛亚洲综合影院| 香蕉久久夜色| 999久久久国产精品视频| 老汉色av国产亚洲站长工具| 一边摸一边抽搐一进一小说| 欧美一级毛片孕妇| 国产伦一二天堂av在线观看| 嫩草影视91久久| 长腿黑丝高跟| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 中文在线观看免费www的网站 | 久久久水蜜桃国产精品网| 操出白浆在线播放| 高清在线国产一区| 全区人妻精品视频| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | cao死你这个sao货| 女警被强在线播放| 亚洲第一电影网av| 欧美性长视频在线观看| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲精品美女久久av网站| av超薄肉色丝袜交足视频| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| e午夜精品久久久久久久| 午夜日韩欧美国产| 神马国产精品三级电影在线观看 | 成人三级做爰电影| 免费在线观看日本一区| 国产午夜精品论理片| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 亚洲国产精品sss在线观看| 免费看美女性在线毛片视频| 国产日本99.免费观看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 中文资源天堂在线| 亚洲国产精品sss在线观看| 欧美黄色片欧美黄色片| 99在线视频只有这里精品首页| 99热这里只有是精品50| www日本在线高清视频| 亚洲成人久久性| 19禁男女啪啪无遮挡网站| tocl精华| 国产片内射在线| 国产精品久久久久久久电影 | 91国产中文字幕| 正在播放国产对白刺激| 国产午夜福利久久久久久| 久久久久久久久久黄片| 好男人在线观看高清免费视频| 看免费av毛片| 黄色 视频免费看| 九色成人免费人妻av| 可以在线观看的亚洲视频| 搡老熟女国产l中国老女人| 日本黄大片高清| 亚洲熟妇熟女久久| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 日本一本二区三区精品| 91字幕亚洲| av有码第一页| 欧美日韩一级在线毛片| 免费观看精品视频网站| 亚洲欧美日韩东京热| 国产精品影院久久| 男人舔女人的私密视频| av有码第一页| www国产在线视频色| 精品国产超薄肉色丝袜足j| av在线天堂中文字幕| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲一区二区三区色噜噜| 五月玫瑰六月丁香| 国产成人aa在线观看| 国产探花在线观看一区二区| 久热爱精品视频在线9| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 岛国在线免费视频观看| 国产97色在线日韩免费| 色综合婷婷激情| 午夜免费成人在线视频| 国产成人精品无人区| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲男人的天堂狠狠| 亚洲专区国产一区二区| 丰满的人妻完整版| a级毛片在线看网站| 午夜精品一区二区三区免费看| 999久久久国产精品视频| 99在线人妻在线中文字幕| av片东京热男人的天堂| 成人永久免费在线观看视频| 一级a爱片免费观看的视频| 1024视频免费在线观看| 欧美大码av| 日韩精品青青久久久久久| 黄频高清免费视频| 一本精品99久久精品77| 12—13女人毛片做爰片一| 国产精品日韩av在线免费观看| 无人区码免费观看不卡| www日本在线高清视频| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 在线观看免费日韩欧美大片| 精品久久久久久久久久免费视频| 一区二区三区高清视频在线| 视频区欧美日本亚洲| 成人国语在线视频| 成年版毛片免费区| 久久精品国产清高在天天线| 99久久国产精品久久久| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 麻豆成人午夜福利视频| 国产熟女xx| АⅤ资源中文在线天堂| 国产成人av教育| 日韩精品中文字幕看吧| 国产午夜精品久久久久久| 国产激情久久老熟女| 免费在线观看影片大全网站| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 美女大奶头视频| 99国产综合亚洲精品| 国产v大片淫在线免费观看| 久久香蕉精品热| 听说在线观看完整版免费高清| 国产日本99.免费观看| 亚洲专区国产一区二区| 精品久久久久久久毛片微露脸| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 亚洲欧美精品综合久久99| 成人一区二区视频在线观看| 国产午夜福利久久久久久| 91成年电影在线观看| 国产成人av激情在线播放| 全区人妻精品视频| 黄片小视频在线播放| 亚洲成av人片免费观看| 欧美久久黑人一区二区| 男女午夜视频在线观看| 国产精品av久久久久免费| 最新在线观看一区二区三区| 色老头精品视频在线观看| 国产高清激情床上av| 国产欧美日韩一区二区精品| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 男人舔女人的私密视频| 免费看美女性在线毛片视频| 久久人妻av系列| 国产男靠女视频免费网站| 久久久久国内视频| 欧美日韩国产亚洲二区| 五月玫瑰六月丁香| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 国产一区二区三区视频了| 久久亚洲真实| 9191精品国产免费久久| 天堂动漫精品| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| av天堂在线播放| 制服诱惑二区| 色老头精品视频在线观看| 精品久久久久久久毛片微露脸| 亚洲av电影不卡..在线观看| 好男人电影高清在线观看| 在线观看午夜福利视频| 日韩欧美在线乱码| 91麻豆精品激情在线观看国产| 成年免费大片在线观看| 欧美日韩黄片免| 搡老妇女老女人老熟妇| 欧美一级a爱片免费观看看 | www.www免费av| 在线国产一区二区在线| 日韩欧美三级三区| 国产单亲对白刺激| 日本黄色视频三级网站网址| 午夜福利免费观看在线| 亚洲avbb在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲黑人精品在线| 精品一区二区三区av网在线观看| 午夜影院日韩av| 日韩高清综合在线| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 国产99久久九九免费精品| 黄色成人免费大全| www日本黄色视频网| 在线看三级毛片| 国产午夜福利久久久久久| 日本精品一区二区三区蜜桃| 精品久久久久久久久久免费视频| 免费在线观看完整版高清| 亚洲avbb在线观看| 亚洲国产看品久久| 一本久久中文字幕| 一级毛片高清免费大全| 国产一区二区在线观看日韩 | 亚洲国产中文字幕在线视频| 精品国产亚洲在线| 欧美zozozo另类| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 一夜夜www| 国产99久久九九免费精品| 在线视频色国产色| 又大又爽又粗| 黄色成人免费大全| 两个人视频免费观看高清| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 欧美中文综合在线视频| av中文乱码字幕在线| 99在线视频只有这里精品首页| 亚洲专区国产一区二区| 亚洲av熟女| 色老头精品视频在线观看| 天天一区二区日本电影三级| 91麻豆精品激情在线观看国产| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 国产精品av视频在线免费观看| 99久久综合精品五月天人人| 午夜影院日韩av| 性欧美人与动物交配| 国产精品久久久av美女十八| 亚洲精品国产一区二区精华液| 草草在线视频免费看| 亚洲国产中文字幕在线视频| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 欧美大码av| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 99热这里只有精品一区 | 亚洲人成网站高清观看| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 五月玫瑰六月丁香| 一级毛片女人18水好多| 国产一区二区在线av高清观看| 成人欧美大片| 日韩三级视频一区二区三区| 可以在线观看毛片的网站| 国产午夜精品久久久久久| 可以在线观看毛片的网站| 国产精品九九99| 一区二区三区国产精品乱码| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产精品一区二区三区四区久久| 精品国产乱子伦一区二区三区| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 成人欧美大片| 久久久精品欧美日韩精品| 一级毛片精品| 露出奶头的视频| 久久久久久久久中文| 俄罗斯特黄特色一大片| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 精品久久久久久久末码| 国产亚洲av高清不卡| 青草久久国产| 不卡一级毛片| 麻豆国产av国片精品| 波多野结衣高清无吗| 亚洲欧美激情综合另类| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 成人亚洲精品av一区二区| 精品国产亚洲在线| 久久亚洲精品不卡| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲精品在线观看二区| 99久久综合精品五月天人人| av在线播放免费不卡| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲熟妇熟女久久| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国产精品九九99| 精品高清国产在线一区| 嫩草影院精品99| 在线观看舔阴道视频| 一个人免费在线观看的高清视频| 色综合婷婷激情| 最近视频中文字幕2019在线8| 久久精品国产综合久久久| 色综合站精品国产| 最新美女视频免费是黄的| 99热只有精品国产| 91老司机精品| 亚洲熟妇熟女久久| 亚洲中文日韩欧美视频| 中文字幕熟女人妻在线| 人妻丰满熟妇av一区二区三区|