正交設(shè)計法優(yōu)選雙益降糖方中葛根素的提取工藝

田春雨 薄海美 喇孝瑾 李繼安 韓 剛 江春花 董玉山 杜晨光

(河北聯(lián)合大學中醫(yī)學院，①臨床醫(yī)學院 河北唐山 063000)

糖尿病是由胰島素缺乏和(或)胰島素生物作用障礙導致的糖、蛋白質(zhì)和脂肪代謝紊亂為特征的一種慢性進行性疾病。目前糖尿病患病率和患者人數(shù)快速增長，2011年11月公布的一項數(shù)據(jù)中顯示，目前我國已經(jīng)確診的糖尿病患者人數(shù)高達9 240萬人，成為世界上糖尿病患者最多的國家，發(fā)病率也高達9.7%。中藥在治療糖尿病方面有著自己獨特的優(yōu)勢(多組分、多靶點)，不僅降低血糖，更重要的是通過辨證論治的方法整體調(diào)節(jié)人體機能，解除患者臨床癥狀，防治多種慢性并發(fā)癥，改善患者的生活質(zhì)量，延長壽命。我們參考了李東垣《脾胃論》治療消渴的“升陽降火湯”[1]組方原則及《醫(yī)學衷中參西錄》滋膵飲的藥物配伍，自擬了雙益降糖方(由葛根、黃連、黃芪、山茱萸等藥組成)，在臨床上取得了良好的療效。為了提高雙益方制劑質(zhì)量，我們將該方中葛根所含的葛根素作為質(zhì)量標準之一，進行了正交設(shè)計的篩選，以期獲得良好的提取工藝。

1 材料與儀器

高效液相色譜儀(Waters 1210);BS224S精密電子天平。葛根素(購自中國藥品生物制品檢定所，批號110752－200912)，流動相所用試劑均為色譜純。黃連、黃芪、葛根、山茱萸等藥物購于唐山市北京同仁堂藥店。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定方法

2.1.1 色譜條件。色譜柱為 Hypersil ODS 5μm(4.6 mm ×100 mm)，流動相為甲醇:水 =22:78，流速:1.0 mL/min，檢測波長:250nm。

2.1.2 供試溶液的制備。對照品溶液制備:精密稱取葛根素對照品適量，用甲醇制成每1 mL含0.05 mg的溶液。供試品溶液制備:取雙益降糖復方醇提干膏0.05g，加乙醇溶液100 mL，超聲提取，濾過，取濾液，即得。

2.1.3 方法學考察

2.1.3.1 線性關(guān)系考察。分別配制不同濃度的葛根素對照品

2.1.3.2 精密度試驗。精密吸取同一對照品溶液20μL，重復進樣6次，結(jié)果葛根素對照品峰面積值的RSD=1.31%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.1.3.3 穩(wěn)定性試驗。按照“2.1.2”項下方法操作，考察同一供試品溶液12 h內(nèi)測定穩(wěn)定性，結(jié)果RSD=1.29%(n=6)，表明本品在12 h內(nèi)測定穩(wěn)定性良好。

2.1.3.4 重復性試驗。按照“2.1.2”項下方法操作，對同一樣品依法測定6次，結(jié)果RSD=1.38%(n=6)，表明本法重復性良好。

2.1.3.5 加樣回收率試驗。平均回收率為99.52%，RSD=1.26%(n=6)。

2.2 提取工藝研究

2.2.1 正交試驗設(shè)計。對主要因素乙醇濃度、溶劑量、回流提取時間及提取次數(shù)進行L9(34)正交實驗，對提取工藝進行優(yōu)選，對提取的干膏進行葛根素含量測定。以葛根素含量為指標，正交因素水平表及結(jié)果見表1、表2。

表1 正交試驗因素水平表

表2 提取工藝L9(34)正交試驗結(jié)果

2.2.2 方差分析

表3 葛根素含量方差分析

按葛根素的含量進行方差分析，A有顯著影響，影響因素A＞C＞B＞D，最優(yōu)組合A2B1C1D3，即乙醇濃度為30%，加醇量為6倍，提取3次，每次1h。

2.2.3 驗證試驗。為驗證制備工藝的可靠性，在A2B1C1D3條件下對6個批次的樣品進行了試驗，結(jié)果葛根素含量分別為0.8526%、0.8678%、0.8496%、0.8522%、0.8650%、0.8528%，RSD為0.89%(n=6)，表明本試驗優(yōu)選的工藝合理。

3 討論

3.1 古今文獻研究 歷代醫(yī)家非常重視脾腎二臟虛弱及飲食所傷在消渴發(fā)病中的作用。如《靈樞·本臟篇》認為:“脾脆則善病消癉易傷，腎脆則善病消癉易傷?！贝苏f明脾腎虧虛是糖尿病易發(fā)病的基礎(chǔ)?！端貑枴て娌≌摗酚衷?“脾癉，此肥美之所發(fā)也，此人必數(shù)食甘美而多肥也，肥者令人內(nèi)熱，甘者令人中滿，故其氣上溢，轉(zhuǎn)為消渴”。這說明古人已經(jīng)清楚認識到飲食不節(jié)是糖尿病發(fā)病的重要誘因。脾虧運化力弱，肥甘太過容易困脾，水谷精微無法上輸于肺，肺津干涸，化燥生熱則口渴喜飲;肺津不足，則不能濡養(yǎng)胃陰致胃火亢盛，腐熟水谷力強，故多食易饑。腎虧則“下焦命門火不歸元，游于肺則為上消，游于胃則為中消?！边@說明脾腎虧虛是導致消渴之本，肺胃有熱則是消渴之標，肥甘厚味是致病之因。據(jù)此，我們參考李東垣《脾胃論》治療消渴的“升陽降火湯”[1]組方原則及《醫(yī)學衷中參西錄》滋膵飲的藥物配伍，自擬了雙益降糖方，方中黃芪益氣健脾;山萸肉補腎澀精;葛根升發(fā)脾胃之陽氣，生津止渴;黃連具有清熱燥濕，瀉火解毒的功效。四味藥為方中主要藥物，在臨床使用中取得了良好的療效。

3.2 前期研究 表明雙益降糖方對2型糖尿病大鼠具有降糖、降脂的作用，其作用機制可能與胰島細胞保護和改善胰島素抵抗有關(guān)[2]。葛根素為該方的主要成分之一，并且其所含葛根素是改善胰島素抵抗的有效成分，實驗研究顯示葛根素可有效降低糖尿病大鼠血糖、血清果糖胺的含量，減少主動脈AGEs(晚期糖基化終末產(chǎn)物)的沉積，控制糖尿病血管病變的發(fā)生發(fā)展[3]。臨床研究顯示葛根素能夠降低糖尿病患者空腹及餐后血糖，改善胰島素抵抗，改善血脂、血液流變學指標[4]。因此在本方提取工藝時選用了葛根素作為本方制劑質(zhì)量控制的指標之一。

本實驗選用不同濃度乙醇回流提取，對提取工藝參數(shù)進行了正交試驗優(yōu)選，乙醇濃度對葛根素的提取有顯著影響，正交試驗優(yōu)選得到的工藝穩(wěn)定、可行。本實驗的研究可為雙益降糖復方制劑工藝及質(zhì)量控制標準的制定奠定基礎(chǔ)。

[1] 李步滿，吳深濤.李東垣陰火理論與消渴病治療思路[J].河北中醫(yī)，2007，29(5):451

[2] 劉志霞，張艷平，吳范武，等.雙益方改善2型糖尿病大鼠糖、脂代謝及作用機制的初步研究[J].遼寧中醫(yī)雜志，2012，39(2):221

[3] 茅彩萍，顧振綸.葛根素對糖尿病大鼠主動脈糖基化終產(chǎn)物的形成及其受體表達的影響[J].中國藥理學通報，2004，20(4):393

[4] 于 健.葛根素治療2型糖尿病患者胰島素抵抗的臨床研究[J].山東中醫(yī)雜志，2001，20(12):727