NMDA受體NR2A亞基在腦缺血后處理中的保護作用

張 茜 涂靜宜 朱 瑩 唐 慧 王瑞敏

(河北聯(lián)合大學醫(yī)學實驗研究中心神經(jīng)生物學研究所 河北唐山 063000;①唐山職業(yè)技術學院病理教研室)

隨著人口老齡化的發(fā)展，腦中風在我國的發(fā)病率及致殘率逐年增加，嚴重增加了人們的生活負擔[1]。對腦中風的研究，最多集中在興奮性谷氨酸受體上。其中，NMDA受體是大家公認的在缺血性腦中風中起重要的作用的離子型谷氨酸受體[2]。NMDA 受體是由3 種亞基構成的:NR1、NR2、NR3[3]。NR1 亞基是其結構亞基，NR2亞基是其調(diào)節(jié)亞基。NR2亞基又分為NR2A－NR2D亞基[4]。有報道證實，NR2A亞基可以誘導長時程增強[5];我們最近的研究證明，腦缺血后處理具有神經(jīng)保護作用[6]。那么，在缺血后處理中，NR2A是否可介導其保護作用尚未見報道，本實驗主要研究NR2A亞基在腦缺血后處理中的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級成年雄性SD大鼠，體質(zhì)量250～300g，由北京維通利華實驗動物中心提供，動物合格證號[SCXK(京)2006－0009]。NR2A一抗(sc－1468)和相應的驢抗羊二抗購自美國Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA，USA)，Cadherin由美國Brann教授贈送，NR2A特異性抑制劑NVPAAM077由瑞士Yves Auberson教授友情贈送;焦油紫購自美國Sigmaaldrich公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒、細胞膜與細胞漿蛋白

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型的建立 本實驗采用四動脈結扎全腦缺血模型[7]，水合氯醛麻醉大鼠后，先分離雙側頸總動脈，留線備用，并電凝其雙側椎動脈。24h后，夾閉雙側頸總動脈缺血8min，距第一次缺血48h行二次缺血3min。實驗動物隨機分為:①假手術組(Sham)②缺血再灌注組(I/R):大鼠缺血8min，不做第二次缺血③缺血后處理組(Postc，Postc+Veh):動物二次缺血3min④抑制劑組(Postc+NVP－A):動物在二次缺血前30min腹腔注射NR2A受體特異性抑制劑NVPAAM077(2mg/ml)⑤Sh+NVP－A組:Sham組動物不做任何處理，僅在二次缺血前30min時間點腹腔注射NR2A受體特異性抑制劑NVPAAM077(2mg/ml)⑥溶劑對照組(Veh):Postc組動物在二次缺血前30min腹腔注射同等體積1%的DMSO。每組4只。

1.2.2 蛋白樣品的制備及Western blotting分別于再灌注3h、6h、12h、24h處死大鼠，低溫下分離腦組織，取出海馬，去除CA3區(qū)，將組織置于液氮中備用。按細胞膜與細胞漿蛋白抽提試劑盒說明，將組織加入細胞膜蛋白提取液勻漿，經(jīng)過4℃，700g離心10min，收集上清，再次4℃，14000g離心30min，收集上清即為漿蛋白，沉淀加裂解液繼續(xù)離心取上清，即為細胞膜蛋白。根據(jù)BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白的濃度，將75ug的蛋白按參考文獻[8]電泳和電轉，蛋白采用5%濃縮膠、7.5%分離膠進行電泳，然后電轉到 PVDF膜上，加一抗過夜(Cadherin和NR2A抗體均為1︰500稀釋)，第二天相應二抗(1:1000稀釋)孵育2h，NBT/BCIP顯色。

1.2.3 焦油紫染色 大鼠于再灌注5d時用10%的水合氯醛(600mg/kg)腹腔麻醉，剪開動物暴露其心臟，將穿刺針從心尖部經(jīng)左心室穿至升主動脈，用止血鉗固定，剪去右心耳，依次用生理鹽水、4%多聚甲醛灌注，灌注完畢后斷頭取腦，置于4%多聚甲醛中，24h后置于30%蔗糖中脫水至完全沉淀，用OCT包埋。組織于用冰凍切片機冠狀切片約15μm，焦油紫染色1h，經(jīng)酒精梯度脫水、二甲苯透明后用樹膠封片。

1.3 圖像分析 蛋白條帶采用Image J軟件進行分析，焦油紫染色的切片在光鏡下計算生存細胞數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用Sigmastat軟件分析，計量資料用均數(shù)±標準差(±s)表示，統(tǒng)計分析采用方差分析(ANOVA)，多個實驗組與一個對照組比較用最小顯著差法 (LSD)，實驗組間比較采用q檢驗(Newman－keuls test)，P＜0.05表示有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 腦缺血再灌注5d各組海馬CA1區(qū)生存神經(jīng)元數(shù) 與I/R組相比，Postc組(Postc+Veh)生存的神經(jīng)元數(shù)目明顯增加(P＜0.05)，抑制劑組(Postc+NVP－A)與I/R組相比，生存的神經(jīng)元數(shù)顯著減少(P ＜0.05)，見圖1。

圖1 焦油紫染色顯示各組海馬CA1區(qū)生存的神經(jīng)元數(shù)

*P ＜0.05 vs.I/R 組;#P ＜0.05 vs.I/R 組

圖2 Western blotting技術檢測NR2A在各時間點的蛋白表達

與缺血再灌注相同時間點相比，* P＜0.05;－:IR;+:Postc

圖3 NVPAAMO77對再灌注24h海馬CA1區(qū)NR2A蛋白表達的影響

與I/R組相比，*P ＜0.05;與I/R組比較，#P ＜0.05

2.2 NR2A免疫印跡檢測結果 如圖2所示，與缺血再灌注組相同時間點相比，Postc組于再灌注3、6、24h和72h時間點NR2A的蛋白表達均顯著升高(P＜0.05)，細胞膜標志蛋白Cadherin的蛋白表達與各個時間點均無顯著變化，表明各組電泳蛋白上樣量相等。

2.3 NVPAAM077對NR2A蛋白表達的影響 如圖3所示，Postc后24h，Postc+Veh組NR2A蛋白表達較缺血再灌注 (I/R)相同時間點明顯增加(P＜0.05)，而 NR2A抑制劑NVPAAMO77可顯著抑制此變化(P＜0.05)。

3 討論

大量的研究已經(jīng)證實，缺血后處理對于腦中風具有保護作用，它可以顯著地降低腦梗死面積[9]，減少缺血性神經(jīng)元損傷[6]。然而，其具體機制尚不清楚?，F(xiàn)代神經(jīng)生物學研究已證實，缺血性腦中風的發(fā)生與谷氨酸的的興奮毒性有著密切的聯(lián)系。谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)最重要的的神經(jīng)遞質(zhì)，NMDA受體是一種主要的離子型谷氨酸受體。在腦中風的主要發(fā)生區(qū)域—前腦中，主要存在的NMDA受體是NR2亞單位，其中主要是NR2A和 NR2B存在于成年小鼠的海馬中[10]。Sakimura等[11]研究證實NR2A基因突變的小鼠空間學習記憶能力和海馬CA1區(qū)的LTP幅值都明顯減弱。NMDA受體的NR2A亞基在全腦缺血后處理中的作用尚未見報道。為了證明這一點，本實驗采用了NR2A受體的特異性抑制劑NVPAAM077，焦油紫染色證實，與Sham組相比，NVPAAM077組海馬CA1區(qū)存活的神經(jīng)元數(shù)明顯減少。因此，我們可以推斷，NR2A亞基在腦缺血中具有保護作用。為了進一步證實這種保護作用，本實驗采用了Western blot觀察再灌技術注 3、6、24、72h NR2A 的表達，結果顯示在缺血后處理組其表達量均高于再灌注組。在再灌注的24hNR2A表達量增加更明顯，取這個時間點測各組NR2A蛋白的含量，可見，與IR組比，抑制劑組NR2A表達明顯減少，而溶劑對照組NR2A含量明顯增加，這些結果證實了缺血后處理是通過激活NR2A亞基起作用的。Liu等[12]采用體內(nèi)和體外研究也發(fā)現(xiàn)，在局灶性腦缺血中，激活NR2A亞基可以促進神經(jīng)元生存。其機制可能是在缺血的早期，由于應激產(chǎn)生的大量的谷氨酸具有神經(jīng)毒性，可以促進神經(jīng)元的死亡，隨后，機體進入自我修復過程，由于NR2A通道的開放，引起鈣內(nèi)流入細胞內(nèi)，從而誘發(fā)其突觸可塑性的一系列反應，促進神經(jīng)元生存。

本實驗表明在缺血后處理腦保護作用中，主要是通過NR2A亞基起作用的，為臨床治療腦中風提供新靶點。

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