T-SPOT.TB技術(shù)檢測胸腔積液在結(jié)核性胸膜炎診斷中的應(yīng)用

劉珍瓊，段永和，張齊龍，葉琳，邊澤源

(江西省胸科醫(yī)院檢驗科，江西，南昌330006)

結(jié)核性胸膜炎是一種常見的肺外病變，表現(xiàn)為淋巴細胞為主的滲出性炎癥，由于該病在臨床上缺乏特異性表現(xiàn)，早期診斷困難，用細菌學(xué)方法檢測陽性率低，胸膜活檢因其為創(chuàng)傷性操作限制了在臨床上的廣泛應(yīng)用，分子生物學(xué)雖提供了快速診斷技術(shù)，但仍存在假陽性和技術(shù)方面的問題。結(jié)核桿菌感染T細胞斑點(T-SPOT.TB)技術(shù)是目前診斷結(jié)核性胸膜炎敏感性較高的細胞學(xué)檢測技術(shù)[1]。我們應(yīng)用T-SPOT.TB技術(shù)檢測外周血單個核細胞(PBMCs)和胸腔積液單個核細胞(PEMCs)中被結(jié)核分枝桿菌早期分泌靶向抗原6(ESAT-6)和培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)致敏的T細胞數(shù)目，來探討胸腔積液細胞學(xué)檢查方法對結(jié)核性胸膜炎的診斷及與其它種類胸腔積液的鑒別診斷價值。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

1.1.1 結(jié)核性胸膜炎組 (TBP組)收集2011年12月至2013年2月本院結(jié)核內(nèi)科、胸外科住院病人32例，其中男性18例，女性14例，年齡18～70歲，入選標(biāo)準(zhǔn)符合《結(jié)核病診治指南》對結(jié)核性胸膜炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 非結(jié)核性胸膜炎組 收集2011年12月至2013年2月本院腫瘤科、呼吸內(nèi)科、胸外科非結(jié)核性胸腔積液病人26例,其中男性17例，女性9例，年齡19～73歲。

1.2 儀器與試劑 青島海爾生物安全柜 (HR40-ⅡA2),CO2培養(yǎng)箱；T-SPOT.TB試劑盒 (英國Oxford Immunotec Ltd)和BD單個核細胞分離器(BD Vacutainer CPT tube)由復(fù)星診斷公司提供。

1.3 檢測方法

1.3.1 外周血單個核細胞(PBMCs)的分離、收集 對每位入選患者采集肝素鋰抗凝的外周血5～10ml，加入等體積RPMI 1640細胞培養(yǎng)液混勻后，加在預(yù)先準(zhǔn)備好的Ficoll淋巴細胞分離液上層，3000 r／min水平離心20 min,用毛細滴管吸取中間層云霧狀細胞，用RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌PBMC 2次，進行顯微鏡下細胞計數(shù)，根據(jù)計數(shù)結(jié)果用無血清AIM-V培養(yǎng)基調(diào)整細胞懸液濃度至2.5×106／ml。

1.3.2 胸腔積液中的單個核細胞(PEMCs)的分離、收集 采集新鮮胸腔積液5～10ml，置肝素鋰抗凝管即刻混勻，其它操作同PBMCs的分離。

1.3.3 檢測過程 在已包被小鼠抗人IFN-γ單克隆抗體的微孔培養(yǎng)板中分別加入作為陰性對照的AIM-V培養(yǎng)基、陽性對照植物血凝素PHA、MTB特異性混合多肽早期分泌靶向抗原6(ESAT-6)與培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)各50μl，然后在各孔中加入調(diào)整好濃度的細胞懸液100μl。將微孔板放在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 16～20h，用 PBS 緩沖液洗板，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的單克隆抗體50μl，在2～8℃下孵育1h后洗板，最后在每孔中加入底物顯色液，室溫下靜置反應(yīng)7 min后用蒸餾水終止反應(yīng)。

1.3.4 T-SPOT.TB試驗結(jié)果判讀 根據(jù)T-SPOT.TB試劑使用說明書，如果陰性對照孔斑點數(shù)(SCF)<6時且 (抗原A或抗原B孔的斑點數(shù))-(陰性對照孔斑點數(shù))≥6，可判斷檢測標(biāo)本為陽性；如果陰性對照孔斑點數(shù)為6～10個時且(抗原A或抗原B孔的斑點數(shù))≥2×(陰性對照孔斑點數(shù))可判斷檢測標(biāo)本為陽性；如果上述標(biāo)準(zhǔn)不符合且陽性質(zhì)控對照孔正常時檢測結(jié)果為“陰性”。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用卡方檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胸腔積液檢測結(jié)果 胸腔積液T-SPOT.TB技術(shù)檢測結(jié)果：TBP組32例患者中30例為陽性，非結(jié)核性胸膜炎組26例中1例為陽性，檢測敏感性為93.75%，特異性為96.15%，假陽性率為3.84%(1/26),假陰性率為6.25%(2/30),陽性預(yù)測值96.77%，陰性預(yù)測值92.59%。

2.2 外周血檢測結(jié)果 外周血T-SPOT.TB技術(shù)檢測結(jié)果：TBP組32例患者中26例為陽性，非結(jié)核性胸膜炎組26例中2例為陽性，檢測敏感性為81.25%；特異性為92.30%，假陽性率為7.69%(2/26),假陰性率為18.75%(6/32),陽性預(yù)測值92.86%，陰性預(yù)測值80%。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，χ2=4.43，0.025

3 討論

結(jié)核分枝桿菌感染的免疫反應(yīng)主要是細胞介導(dǎo)。作為細胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)的一部分，T細胞被結(jié)核分枝桿菌抗原致敏，當(dāng)這些抗原再次刺激時，活化的效應(yīng)T細胞，主要CD4、部分CD8細胞產(chǎn)生抗結(jié)核感染免疫中的關(guān)鍵性細胞因子干擾素-γ(IFN-γ)[2，3]。 T-SPOT.TB 技術(shù)以 ESAT-6 和 CFP-10 作為刺激抗原，刺激外周血單個核細胞(PBMCs)和胸腔積液單個核細胞(PEMCs)，如果機體存在結(jié)核感染效應(yīng)T淋巴細胞，經(jīng)ESAT-6和CFP-10刺激后,通過體外的細胞培養(yǎng)，刺激底物和效應(yīng)T淋巴細胞產(chǎn)生大量細胞因子IFN-γ，再通過酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)(ELISPOT)檢測IFN-γ分泌T細胞數(shù)目來證實機體存在結(jié)核感染。由于ESAT-6和CFP-10這兩種蛋白由結(jié)核桿菌的RDl基因序列合成，而該基因序列僅存在于致病性結(jié)核桿菌之中，環(huán)境中的非典型分枝桿菌和卡介苗中均不含該基因序列[4]，故將上述兩種結(jié)核感染的特異性抗原作為刺激物來進行T-SPOT.TB檢測，從理論上保證了TSPOT.TB的高度特異性。另一方面ESAT-6和CFP-10兩種抗原聯(lián)合檢測綜合了單一抗原優(yōu)勢，可針對外周血或胸腔積液單個核細胞上的不同表位進行刺激，產(chǎn)生IFN-γ，具有更強的活化能力，比單一抗原更為靈敏。因此，ESAT-6和CFP-10兩種抗原作為特異性刺激抗原具備更高的檢測敏感性和特異性，從而為臨床癥狀不典型、抗酸染色、結(jié)核桿菌培養(yǎng)均呈陰性的疑似結(jié)核桿菌感染和隱性結(jié)核桿菌感染患者提供有效的診斷方法[5]。

表1 結(jié)核性胸膜炎胸腔積液與外周血T-SPOT.TB檢測結(jié)果比較

目前國內(nèi)的研究多采用結(jié)核感染患者的外周血進行T-SPOT.TB檢測[6-8]，可是國外有學(xué)者認(rèn)為，結(jié)核抗原特異性T細胞具有向病變部位集中的特點，T-SPOT．TB技術(shù)的檢測物已不僅局限于外周血，同時也可用于支氣管肺泡灌洗液、痰液、胸腹水、腦脊液等對肺內(nèi)及肺外結(jié)核的診斷[9]。Losi等[10]認(rèn)為胸腔積液中的單個核細胞比外周血更有診斷價值。本試驗選擇來自病變部位的胸腔積液作為檢測對象，通過T-SPOT.TB技術(shù)檢測受感染組織中的T細胞反應(yīng)因子，能夠提高活動性結(jié)核診斷的敏感性和特異性。試驗結(jié)果顯示，胸腔積液單個核細胞T-SPOT.TB技術(shù)檢測結(jié)核性胸膜炎的敏感性為93.75%、特異性96.15%，而外周血單個核細胞敏感性則為81.25%、特異性92.30%。表明受感染組織的T-SPOT.TB技術(shù)較單純外周血檢測對診斷活動性結(jié)核病敏感性和特異性更高。Lee等[11]對40例胸腔積液患者(其中19例結(jié)核性胸膜炎)的胸腔積液和外周血單個核細胞進行T-SPOT.TB檢測,胸腔積液的敏感性和特異性分別為94.7%、85.7%，外周血的敏感性和特異性分別為77.8%、90.5%。本試驗胸腔積液的結(jié)果與Lee等的基本一致，外周血的敏感性比Lee等的研究結(jié)果要高，但是比國內(nèi)張瑛等[6]、肖倩等[7]研究結(jié)果要低。本試驗TBM組有2例胸腔積液檢測呈陰性反應(yīng)，分析原因可能是患者經(jīng)治療后體內(nèi)的特異性T細胞數(shù)目迅速減少而造成的假陰性，對照組出現(xiàn)一例陽性，該患者為肺癌病人，分析其原因可能是患者曾經(jīng)有過結(jié)核分枝桿菌的潛伏性感染，當(dāng)然也不能排除腫瘤合并結(jié)核感染的可能。

綜上所述，外周血和胸腔積液單個核細胞TSPOT.TB技術(shù)都可以作為當(dāng)前診斷結(jié)核性胸膜炎的輔助方法，但是胸腔積液單個核細胞T-SPOT.TB技術(shù)較外周血具有更好的敏感性和特異性。

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