p53基因與PTEN基因共轉(zhuǎn)染對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞凋亡的影響

于立春，盛玉文，曲更慶，王慶軍，孫世寶

遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 泌尿外科，遼寧錦州 121001

近年研究發(fā)現(xiàn)，在多形性神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、原發(fā)性前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌等人類腫瘤中，張力蛋白同源物(phosphatase and tension homologue deleted on chromosome 10，PTEN)發(fā)生了不同程度的缺失和突變[1]。在各型白血病細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)PTEN有不同程度的突變和缺失[2]。目前人類最重要的抑癌基因是p53，在人類一半以上的腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)了p53基因的突變[3]。p53介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與細(xì)胞內(nèi)其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路間的聯(lián)系十分復(fù)雜，近年研究發(fā)現(xiàn)，p53和PTEN在前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌存在相互關(guān)聯(lián)的作用[4]。本研究旨在探討共轉(zhuǎn)染野生型p53基因和PTEN基因?qū)Π螂装㏕24細(xì)胞凋亡的影響。

材料和方法

1 細(xì)胞和試劑 人膀胱腫瘤T24細(xì)胞株(中國(guó)科學(xué)院上海分院)；小牛血清(Hyclone公司)；抗生素潮霉素B(hygro-mycin B)、LipofectAMINETM2000、攜帶野生型p53基因、PTEN基因、重組質(zhì)粒pVITR02-hp53、pVITR02-h PTEN和pVITR02-hp53-hPTEN的大腸埃希菌(Takara公司)；RNA提取試劑盒、TRIzol溶液以及RPMI 1640培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco公司)；質(zhì)粒抽提試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Promega公司)；鼠抗人PTEN、鼠抗人p53單克隆抗體(SANTA CRUZ公司)。引物合成和DNA測(cè)序由武漢英騏生物技術(shù)有限公司完成。

2 細(xì)胞培養(yǎng)和基因轉(zhuǎn)染 T24細(xì)胞用含10%胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)液(加雙抗)，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%)，每2~3 d換液1次，待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底部80%左右時(shí)進(jìn)行傳代，待傳至5~6代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。按產(chǎn)品說(shuō)明書操作方法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將攜帶有重組質(zhì)粒的大腸埃希菌進(jìn)行擴(kuò)增和培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒；實(shí)驗(yàn)分空白質(zhì)粒(pVITR02)轉(zhuǎn)染組(A組)、攜帶p53基因質(zhì)粒(pVITR02-hp53)轉(zhuǎn)染組(B組)、攜帶PTEN基因質(zhì)粒(pVITR02-hPTEN)轉(zhuǎn)染組(C組)、聯(lián)合攜帶p53-PTEN基因質(zhì)粒(pVITR02-hp53-hPTEN)轉(zhuǎn)染組(D組)，每實(shí)驗(yàn)組各取4 μg質(zhì)粒，分別放入10 μl的LipofectAMINETM 2000中充分混勻，待靜置20 min分別加入1×106個(gè)T24細(xì)胞中，于6孔板中培養(yǎng)，待24 h后可按1∶10進(jìn)行傳代，待36 h后加入濃度為200 μg/ml潮霉素B進(jìn)行篩選，篩選后繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增[5]。

3 RT-PCR法檢測(cè)目的基因的表達(dá) 抽提總的RNA：經(jīng)過(guò)篩選獲得的轉(zhuǎn)染細(xì)胞用0.25%胰酶消化后，收集細(xì)胞，洗滌細(xì)胞(用PBS液)2次，加入TRIzol溶液1 ml，吹打、振蕩10 min，最后加入氯仿0.2 ml，在2~8 ℃條件下離心5 min(12 000×g)，收集上清，加入異丙醇沉淀RNA 0.5 ml，最后溶于雙蒸水中(用焦碳酸二乙酯處理后)。取總RNA 1 μg，溶于20 μl反應(yīng)體系中，加入隨機(jī)引物500 ng，RNAsin 20 U和Mo-MLV反轉(zhuǎn)錄酶200 U，70 ℃條件下反應(yīng)10 min，40 ℃條件下靜置2 h，在-20 ℃保存cDNA產(chǎn)物以備用。用參考文獻(xiàn)[6]提供的方法進(jìn)行p53基因引物設(shè)計(jì)，5'-CAGCCAAGTCTGTGACTTG CCG-TAC-3'為上游引物，5'-CTATGTCGAAAAGT GTITCTGTCATC-3'為下游引物。擴(kuò)增條件：94 ℃(預(yù)變性)3 min， 94 ℃(變性)30 s、 56 ℃(退火)30 s、72 ℃(延伸)30 s，共30個(gè)循環(huán)。參照GenBank提供的PTEN基因序列，5'-CAGCCAAGTCTGTGACTT GCCG-TAC-3'為上游引物，5'-CCGCTCGAGCAGT CGCTGCAACCATCCA-3'為下游引物，擴(kuò)增條件：94 ℃(預(yù)變性)5 min，94 ℃(變性)30 s，60 ℃(退火)30 s，72 ℃(延伸)1 min，循環(huán)30次。待目的片段的擴(kuò)增體系達(dá)到總體積為25 μl時(shí)，加入Taq酶1.0 U、引物82.5 ng和cDNA 2 μl。取10μl擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在溴化乙錠(ethidium bromide，EB)染色后，觀察電泳結(jié)果(在紫外燈下)，攝片記錄。在熒光顯微鏡下觀察各組(空載體組、p53基因轉(zhuǎn)染組、PTEN基因轉(zhuǎn)染組和p53基因聯(lián)合PTEN基因共轉(zhuǎn)染組)綠色熒光蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。

4 細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4組T24細(xì)胞(轉(zhuǎn)染后)即A組、B組、C組和D組，接種于24孔板中(按照每孔300個(gè)/ml的細(xì)胞密度)，每組設(shè)5個(gè)平行孔。培養(yǎng)7 d(在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的飽和濕度環(huán)境)，棄去上清液，洗滌細(xì)胞2次(用PBS)，加入甲醇溶液5 ml固定15 min后，再加入吉姆薩染色液200 μl染色細(xì)胞20 min，用流水沖洗去除染色液，待干燥后，計(jì)數(shù)＞1 mm視野的集落數(shù)目(在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行)。

5 Western blotting檢測(cè)p53、PTEN蛋白表達(dá) 分別收集4組細(xì)胞，提取每組細(xì)胞的蛋白，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定四組及標(biāo)準(zhǔn)品的蛋白含量。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離， 然后轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜(或PVDF膜)上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，并洗膜，加入按1∶500倍稀釋的鼠抗人PTEN單克隆抗體，在4 ℃條件下過(guò)夜。洗膜后加入二抗(用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記)，作用1 h(室溫)，洗膜后用ECL顯色，并在暗室曝光，用顯影定影后掃描分析，用蛋白表達(dá)強(qiáng)度表示其結(jié)果。

6 Annexin V-FITC V/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率分別取4組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的T24細(xì)胞，分別進(jìn)行消化、離心，并收集制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml，取細(xì)胞懸液100 μl，分別加入用FITC標(biāo)記的Annexin V 5 ml和碘化丙啶(propidium iodide，PI)5 ml，及時(shí)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用-x±s表示，采用單因素方差分析法，兩兩比較用q檢驗(yàn)，方差不齊用Dunnett-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 基因轉(zhuǎn)染后p53和PTEN mRNA的表達(dá) RTPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，B組和C組中分別有p53和PTEN mRNA的表達(dá)，D組中p53和PTEN mRNA同時(shí)存在。見(jiàn)圖1。

圖 l RT-PCR檢測(cè)p53和PTEN mRNA在T24細(xì)胞中的表達(dá)A： 實(shí)驗(yàn)分空白質(zhì)粒(pVITR02)轉(zhuǎn)染組; B: 攜帶p53基因質(zhì)粒(pVITR02-hp53)轉(zhuǎn)染組； C：攜帶PTEN基因質(zhì)粒(pVITR02-hPTEN)轉(zhuǎn)染組； D： 聯(lián)合攜帶p53-PTEN基因質(zhì)粒(pVITR02-hp53-hPTEN)轉(zhuǎn)染組

2 熒光顯微鏡下重組質(zhì)粒的表達(dá) 在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后的B、C、D組細(xì)胞(在轉(zhuǎn)染后48 h效果最好)，可見(jiàn)綠色熒光主要集中在細(xì)胞質(zhì)中，即綠色熒光蛋白表達(dá)成功(圖2)。A組未見(jiàn)熒光蛋白表達(dá)，B、C、D組細(xì)胞的熒光蛋白表達(dá)無(wú)明顯差別。見(jiàn)圖2。

3 細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn) p53和(或)PTEN經(jīng)過(guò)B組、C組以及D組共轉(zhuǎn)染后，集落數(shù)在各組T24細(xì)胞中均有減少，B組、C組和D組與A組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

4 T24細(xì)胞中p53、PTEN蛋白的表達(dá) Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)圖3中p53蛋白表達(dá)提示B、D組與C、A組相比明顯增加(圖3) (P＜0.05)，且D組高于B組(P＜0.05)。PTEN蛋白的表達(dá)，C、D組與B、A組相比明顯增加(圖4) (P＜0.05)，且D組高于C組(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

5 Annexin V-FITC V/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率Annexin V-FITC V/PI雙染法檢測(cè)結(jié)果顯示：B組、C組和D組明顯高于A組(P＜0.05)，且D組明顯高于B組和C組(P＜0.05）見(jiàn)圖5、表3。

圖 3 Western blotting檢測(cè)p53基因蛋白表達(dá)情況

圖 4 Western blotting檢測(cè)PTEN基因蛋白表達(dá)情況

表l p53和PTEN基因轉(zhuǎn)染對(duì)T24細(xì)胞集落形成數(shù)的影響(-x±s，n=5)

表2 不同組別中p53、PTEN蛋白的表達(dá)(-x±s，n=5)

表3 p53和PTEN基因轉(zhuǎn)染對(duì)T24細(xì)胞凋亡率(-x±s，n=5)

討 論

基因治療已經(jīng)成為腫瘤治療的新探索。其中抑癌基因治療是腫瘤基因治療的方法之一，在正常細(xì)胞中抑癌基因失活、突變和(或)癌基因的過(guò)度激活等都有可能引起腫瘤的發(fā)生，基于這一點(diǎn)將正常功能的野生型抑癌基因轉(zhuǎn)染到腫瘤細(xì)胞中，并在腫瘤細(xì)胞表達(dá)，恢復(fù)細(xì)胞正常的生長(zhǎng)表型，從而達(dá)到抑制腫瘤的作用。人類p53基因是由11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子組成，位于17p13.1，長(zhǎng)度約20 kb，是目前研究最廣泛和最深入的一種抑癌基因，具有多種生物學(xué)功能：能夠阻滯細(xì)胞有絲分裂的周期；其蛋白的表達(dá)能夠抑制腫瘤血管的形成；能夠促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[7-9]。PTEN基因有9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子，位于10q23.3，由200 kb組成，是到目前為止發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具有磷酸酶活性的抑癌基因[10]。PTEN編碼的是一種多功能蛋白質(zhì)，同時(shí)具有蛋白磷酸酶活性和脂質(zhì)磷酸酶活性，通過(guò)干擾PI3K/AKT的信號(hào)傳導(dǎo)，使細(xì)胞在細(xì)胞周期G期受到阻滯[11]。其生物學(xué)功能主要是：使細(xì)胞遷移、鋪展、局部黏附和增殖受到抑制；當(dāng)其等位基因丟失時(shí)會(huì)引起皮膚、胃腸道、前列腺的腫瘤，這與PTEN基因參與胚胎的正常發(fā)育有關(guān)，最近研究發(fā)現(xiàn)PTEN基因的異常表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致白血病的發(fā)生；PTEN蛋白表達(dá)能抑制腫瘤血管形成[12]。在人類自發(fā)腫瘤和遺傳病中，p53與PTEN有較高的突變率，但兩種基因同時(shí)發(fā)生突變的發(fā)生率較小[13-15]。在制作鼠的前列腺癌實(shí)驗(yàn)中得出這樣的結(jié)論：p53與PTEN在抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展方面存在互補(bǔ)作用，這種相互作用具有深刻的分子機(jī)制[16]。

圖 5 p53和PTEN基因轉(zhuǎn)染對(duì)T24細(xì)胞凋亡率的影響

Ogawara等[17]研究發(fā)現(xiàn)，PTEN使AKT的活化受到抑制，從而MDM2蛋白Serl66不能被磷酸化活化，隨后在細(xì)胞質(zhì)中被降解，抑制腫瘤的發(fā)生。Chang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，PTEN通過(guò)作用于啟動(dòng)子MDM2從而導(dǎo)致MDM2基因轉(zhuǎn)錄被抑制，MDM2活性受到抑制，增強(qiáng)了抑瘤功能。在我們檢測(cè)細(xì)胞凋亡率時(shí)也發(fā)現(xiàn)：p53基因聯(lián)合PTEN基因共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的凋亡率明顯高于空染體組和兩個(gè)單染組。

Tang和Eng[19]研究發(fā)現(xiàn)，PTEN和p53形成的復(fù)合物可以增強(qiáng)p53轉(zhuǎn)錄及其蛋白的穩(wěn)定性[19-22]。這和Freeman等[20]研究發(fā)現(xiàn)類似，當(dāng)PTEN和p53結(jié)合后，從而穩(wěn)定了P53蛋白；也使p53的DNA結(jié)合能力增強(qiáng)，相應(yīng)的p53的轉(zhuǎn)錄活性也增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)的Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染組(pVITR02-hp53-hPTEN轉(zhuǎn)染組)蛋白表達(dá)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)于單轉(zhuǎn)組(pVITR02-hp53、pVITR02-hPTEN)和空轉(zhuǎn)染組，這與兩者的相互作用和維持正常細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性、凋亡功能和正常細(xì)胞周期有關(guān)。Wang等[23]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)敲除p53基因時(shí)，磷酸化PTEN蛋白表達(dá)水平明顯降低，p53可以激活PTEN轉(zhuǎn)錄，通過(guò)直接結(jié)合PTEN上游序列，抑制了細(xì)胞PI3KAkt信號(hào)傳導(dǎo)。這點(diǎn)我們用Western blotting檢測(cè)可以得到證實(shí)，即共轉(zhuǎn)染組蛋白表達(dá)顯著高于單用PTEN組。

本研究結(jié)果顯示，p53和PTEN基因均可誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞T24的凋亡，共轉(zhuǎn)染組較單基因轉(zhuǎn)染組可更顯著地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。說(shuō)明這2種基因在膀胱癌細(xì)胞T24細(xì)胞凋亡方面具有協(xié)同增強(qiáng)作用，其作用機(jī)制可能與2種基因在細(xì)胞周期監(jiān)控和細(xì)胞凋亡上相互調(diào)節(jié)相互協(xié)同等方面有著重要作用。這種相互作用對(duì)細(xì)胞周期和凋亡產(chǎn)生較大影響。

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