脫酚葡萄籽粉發(fā)酵液抗氧化活性研究

王臣東，劉文明，王 婷，田繼霞，李彩霞，焦 揚(yáng)

(河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅張掖734000)

葡萄酒生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物如葡萄籽、葡萄皮。目前，對葡萄籽成分的開發(fā)利用主要為葡萄籽油、多酚類物質(zhì)，而對葡萄籽蛋白質(zhì)的利用極少。葡萄籽中含有11%～13%的蛋白質(zhì)。與蛋白質(zhì)相比，活性肽不僅有比蛋白質(zhì)更好的消化吸收性能，還具有多種生理功能，如:抗氧化、降血壓、調(diào)節(jié)血脂水平、提高免疫力、促進(jìn)礦物質(zhì)的運(yùn)輸和吸收等［1-2］。目前，生產(chǎn)多肽的方法主要有酸解法［3］、酶解法［4］、生物發(fā)酵法［5］。與酶解法相比，發(fā)酵法的優(yōu)勢是能將微生物產(chǎn)酶和酶水解兩步合一，省去酶的分離和提純步驟，減少生產(chǎn)工藝，降低成本。葡萄籽中含有大量多酚類物質(zhì)，且多酚類物質(zhì)易與蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)合沉淀。本文以經(jīng)堿液浸泡脫酚處理后的葡萄籽為原料，采用產(chǎn)胞外堿性蛋白酶的菌株地衣芽孢桿菌(bacillus licheniformis)培養(yǎng)發(fā)酵，比較了不同處理方式對脫酚葡萄籽粉發(fā)酵液多酚和多肽量的影響，并考察了發(fā)酵液對羥基自由基、超氧陰離子自由基、DPPH 自由基的清除效果。以期為葡萄籽蛋白的利用提供理論依據(jù)，進(jìn)一步為葡萄籽的綜合利用開辟新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葡萄籽 由甘肅張掖國風(fēng)葡萄酒業(yè)有限公司提供;地衣芽孢桿菌30203(bacillus licheniformis) 購于甘肅省微生物保藏中心;斜面培養(yǎng)基 LB 固體培養(yǎng)基;種子培養(yǎng)基 蛋白胨0.5%，酵母浸粉0.5%，葡萄糖1.0%，磷酸氫二鉀0.5%，硫酸鎂0.02%;產(chǎn)酶培養(yǎng)基 酵母浸粉0.2%，糊精0.6%，磷酸氫二鉀0.2%，氯化鈣0.06%，干酪素0.2% 所用藥品均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 葡萄籽粉處理方式

1.2.1.1 萄萄籽脫酚方法 參照文獻(xiàn)［6］，將葡萄籽從釀酒后葡萄皮渣中分離，用0.05mol/L NaOH 固液比1∶10 浸泡，80℃水浴浸泡30min，重復(fù)三次，清水沖洗葡萄籽，干燥，粉碎過40 目篩，即得到脫酚葡萄籽粉。采用凱氏定氮法測得總蛋白含量12.65%，65℃恒重法測得水分含量10.5%。

1.2.1.2 地衣芽孢桿菌培養(yǎng)方法 將斜面保存的地衣芽孢桿菌轉(zhuǎn)接在平板上，培養(yǎng)24h 后，將單菌落接入裝液量20mL/100mL 的種子培養(yǎng)液中，于32℃，150r/min，振蕩培養(yǎng)14～16h，使菌濃OD600達(dá)到1.2～1.5 之間。將種子液以10% 接種量接入裝液量60mL/250mL 的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于34℃，150r/min，振蕩培養(yǎng)8h，得地衣芽孢桿菌和堿性蛋白酶(酶量為180～210U/mL)混合液。

1.2.1.3 葡萄籽粉液制備方法 將地衣芽孢桿菌和堿性蛋白酶混合液以50%的比例加入固液比1 ∶12的葡萄籽粉液中，于34℃，150r/min，振蕩培養(yǎng)，得到葡萄籽粉發(fā)酵液。以葡萄籽粉液不接菌僅加入等量滅菌蒸餾水為參比Ⅰ，葡萄籽粉液接入等量種子菌液為參比Ⅱ，葡萄籽粉液加入等量的滅菌產(chǎn)酶培養(yǎng)液為參比Ⅲ。

1.2.2 多酚測定方法 采用Folin-Ciocalteu 比色法［7］測定提取液中的多酚含量。

1.2.3 多肽含量測定

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 參考文獻(xiàn)［8］，用5%的TCA 配制0.3mg/mL 的Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL 加蒸餾水至6.0mL，然后加入4.0mL 雙縮脲試劑，于漩渦混合儀上混合均勻，于2000r/min 離心10min，取上清液測定A540值。以多肽的含量為縱坐標(biāo)C(mg)，A 值為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程:

1.2.3.2 樣品中多肽含量測定 取2.0mL 葡萄籽粉液，加入2.0mL 10%(W/V)的TCA 水溶液，于漩渦混合儀上混合均勻，靜置10min，然后在4000r/min下離心15min，取上清液3.0mL，加入雙縮脲試劑2.0mL，于漩渦混合儀上混合后，2000r/min 離心10min，取上清液于540nm 下測定OD 值，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，求得樣品溶液中多肽含量C(mg)。

一次澆筑實(shí)際體積相對較大，而斷面卻很小，底板厚度可達(dá)95cm，兩側(cè)厚度也超過200cm，為局部大體積混凝土，為避免卡開裂，應(yīng)做好溫度控制。在施工過程中，應(yīng)密切留意入模溫度與澆筑速度，在必要的情況下采用摻加冰塊的方法進(jìn)行降溫。在完成澆筑后，應(yīng)及時(shí)進(jìn)行覆蓋與灑水養(yǎng)護(hù)。

1.2.4 抗氧化活性測定

1.2.4.1 對羥自由基(·OH)的清除率 利用H2O2與FeSO4混合產(chǎn)生·OH，在體系內(nèi)加入水楊酸能有效地捕捉·OH 并產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在波長510nm 處有最大吸收［9］。

在10mL 的試管中依次加2mL 6mmol/L 硫酸亞鐵溶液，2mL 6mmol/L 水楊酸溶液和2mL 葡萄籽粉液，混合均勻后，加2mL 6mmol/L 雙氧水溶液啟動(dòng)反應(yīng)，于37℃恒溫反應(yīng)30min，以蒸餾水為參比，考慮到樣品本身的吸光值，不加顯色劑雙氧水得到本底吸光值。對羥自由基(·OH)的清除效率可根據(jù)下式進(jìn)行計(jì)算:

式中:A0-為未加發(fā)酵液的空白對照值，Ai-加發(fā)酵液的測定值，Aj-為本底吸收值。

1.2.4.2 對超氧陰離子的清除率 采用了鄰苯三酚自氧化法［10］。取4.5mL pH8 的2.5mmol/L Tris-HCl緩沖溶液，1.0mL 葡萄籽粉液，2.4mL 蒸餾水，混勻后在25℃水浴中保溫20min，取出后立即加入在25℃預(yù)熱過的3mmol/L 的鄰苯三酚0.1mL，迅速搖勻后倒入比色杯，于325nm 下每隔30s 測定吸光度，計(jì)算線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的增加。計(jì)算抑制率。

式中:ΔA0為鄰苯三酚的自氧化的速率;ΔAi為加入樣液溶液后鄰苯三酚自氧化的速率。

1.2.4.3 對DPPH 自由基的清除率 參照文獻(xiàn)［11］稍作修改，將0.1mL 葡萄籽粉液于0.4mL 100mmol/L Tris- HCl(pH8.2)混勻后，加入2.0mL 0.2mmol/L DPPH 乙醇溶液，搖勻，在暗處放置30min，測定517nm 波長處的吸光度Ai，以2.0mL70%乙醇為參比的本底吸光值，空白對照組以2.0mL 無水乙醇代替樣品。DPPH 自由基清除率按以下公式計(jì)算。

式中:A0-為空白對照吸光值，Ai-為樣液的吸光值，AJ-為參比的本底吸光值。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 每個(gè)處理做3 次重復(fù)，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差反映各指標(biāo)的大小。Origin Lab7.5 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 處理方式對脫酚葡萄籽粉液多肽含量的影響

地衣芽孢桿菌屬(B.licheniformis)微生物是目前工業(yè)用于發(fā)酵生產(chǎn)堿性蛋白酶的主要菌種。多數(shù)微生物所產(chǎn)堿性蛋白酶，具有水解蛋白脂鍵、酰胺鍵和轉(zhuǎn)脂及轉(zhuǎn)肽的能力。在大豆蛋白加工業(yè)中，用堿性蛋白酶改性大豆蛋白，可以提高其保健功能。實(shí)驗(yàn)用地衣芽孢桿菌30203 菌株所產(chǎn)蛋白酶為胞外酶。采用先培養(yǎng)地衣芽孢桿菌使其菌體繁殖和產(chǎn)堿性蛋白酶達(dá)一定程度后，加入一定固液比的脫酚葡萄籽粉，考察發(fā)酵時(shí)間和不同處理方式下發(fā)酵液中多肽變化。結(jié)果如圖1 所示。

由圖1 可見，隨時(shí)間變化，未接入菌液的參比Ⅰ和參比Ⅲ多肽含量的變化不明顯，基本在1.19 ～1.42g/L。參比Ⅱ在前24h 內(nèi)多肽含量和參比Ⅰ基本持平在1.23g/L 左右，而24h 以后多肽含量明顯增加至2.60g/L。對脫酚葡萄籽發(fā)酵液而言，時(shí)間對其多肽含量影響較明顯。在24h 內(nèi)發(fā)酵液多肽含量即達(dá)到2.35g/L 左右，隨時(shí)間延長多肽含量增大，在72h即達(dá)到最大值4.23g/L，之后多肽量基本保持不變。由此可見，未接入菌液的參比Ⅰ和參比Ⅲ處理方式下，多肽含量較低，接菌處理后可以明顯提高多肽含量，并以先培養(yǎng)菌株使其繁殖和產(chǎn)堿性蛋白酶達(dá)到一定程度后，加入一定固液比的脫酚葡萄籽粉的處理方式下得到多肽的量最大。

圖1 處理方式對脫酚葡萄籽粉液中多肽濃度的影響Fig.1 The influence of processing mode on peptides concentration of grape seed powder removed phenolic solution

2.2 處理方式對葡萄籽粉液多酚含量的影響

對一定固液比的脫酚葡萄籽，設(shè)置不同處理方式的pH 為8.0?？疾炝瞬煌幚矸绞较露喾拥淖兓＝Y(jié)果如圖2 所示。

圖2 處理方式對脫酚葡萄籽粉液中多酚濃度的影響Fig.2 The influence of processing mode on polyphenol concentration of grape seed powder removed phenolic fluid

由圖2 可見，參比Ⅰ和參比Ⅲ的多酚含量相當(dāng)，在60mg/L 左右，且隨時(shí)間延長多酚含量有降低趨勢。參比Ⅱ和發(fā)酵液的多酚含量，隨發(fā)酵時(shí)間延長，多酚含量先增加后又降低，在72h 分別達(dá)到最大量80.74、128.83mg/L。由此可見，葡萄籽整粒脫酚磨粉后以堿性條件(pH8.0)處理，還是有一定量的殘余多酚類物質(zhì)，而且通過地衣芽孢桿菌的發(fā)酵和堿性蛋白酶的作用，葡萄籽粉組織內(nèi)的多酚類物質(zhì)會釋放出來，但隨時(shí)間延長，多酚類物質(zhì)可能發(fā)生了氧化或與蛋白共沉作用而有所降低。

2.3 葡萄籽粉液的抗氧化活性

2.3.1 脫酚葡萄籽粉液對羥自由基的清除作用 ·OH是最活潑的氧自由基，對生物體危害較大，可與活細(xì)胞中的任何分子發(fā)生反應(yīng)而對機(jī)體造成損傷［12-13］?？疾炝瞬煌幚矸绞降钠咸炎逊垡簩αu自由基的清除作用。結(jié)果如圖3 所示。

由圖3 可見，四種處理方式下脫酚葡萄籽粉液對羥自由基的清除作用差異顯著。相對來說發(fā)酵液最好，參比Ⅱ次之，而參比Ⅰ最差其清除率在20%左右。且對羥自由基的清除效果的趨勢與多肽量變化圖1 很相似，但隨時(shí)間延長，清除率降低?？赡艿脑蛴卸?其一，堿性蛋白酶作用于脫酚葡萄籽粉后其水解得到的多肽組成可能為多種肽片段，且對羥自由基的清除不呈量效關(guān)系［14］。其二，在對羥自由基的清除作用中，多肽和多酚可能相互作用，而減弱了清除效果。結(jié)合圖1 和圖2 可得，在實(shí)驗(yàn)的處理方式下，脫酚葡萄籽粉液對羥自由基的清除效果主要由堿性蛋白酶水解得到的多肽類物質(zhì)起作用，而且可能得到的是不同分子量大小的多肽類物質(zhì)［5，14］。

圖3 脫酚葡萄籽粉液對羥自由基的清除效果Fig.3 Scavenging effect to hydroxy free radical of grape seed powder removed phenolic fluid

2.3.2 脫酚葡萄籽粉液對超氧自由基的清除作用超氧陰離子自由基是生命代謝過程中產(chǎn)生的一種重要的自由基，具有很強(qiáng)的氧化能力?？疾炝瞬煌幚矸绞降钠咸炎逊垡簩Τ蹶庪x子自由基的清除作用。結(jié)果如圖4 所示。

圖4 脫酚葡萄籽粉液對超氧陰離子自由基的清除效果Fig.4 Scavenging effect to superoxide free radicals of grape seed powder removed phenolic fluid

由圖4 可見，不同處理方式下脫酚葡萄籽粉液對超氧自由基的清除率的差異不顯著，參比Ⅰ和參比Ⅲ的清除率相當(dāng)，在50%左右，參比Ⅱ?qū)Τ踝杂苫那宄首畲笾禐?7.35%，而脫酚葡萄籽粉發(fā)酵液對超氧自由基的清除率最大為72.76%。楊碧霞等［15］研究表明，葡萄籽多肽對羥基自由基和超氧自由基的清除能力差異明顯，當(dāng)?shù)鞍酌该附夂蟮入婞c(diǎn)沉淀的多肽濃度達(dá)8g/L 時(shí)，對兩者的清除率分別為93.10%和42.79%。結(jié)合圖1 可得，堿性蛋白酶水解脫酚葡萄籽粉得到的多肽類物質(zhì)對超氧自由基的清除作用不明顯，而葡萄籽粉液的自身水溶性物質(zhì)，如水溶性較好的低聚合度的原花青素［16］、白藜蘆醇［17］等在清除超氧陰離子自由基方面發(fā)揮著主要作用，但堿性蛋白酶和地衣芽孢桿菌對葡萄籽粉的作用使其對超氧自由基的清除效果提高了約20%。

2.3.3 脫酚葡萄籽粉液對DPPH 自由基的清除作用 DPPH·是一種穩(wěn)定的含氮自由基，當(dāng)待測物質(zhì)含有抗氧化物時(shí)，抗氧化物提供一個(gè)電子與其配對結(jié)合，使DPPH·的特征紫色消失，根據(jù)褪色程度的大小來評價(jià)抗氧化劑的抗氧化性［18］?？疾炝瞬煌幚矸绞降钠咸炎逊垡簩PPH 自由基的清除作用。結(jié)果如圖5 所示。

圖5 脫酚葡萄籽粉液對DPPH 自由基的清除效果Fig.5 Scavenging effect to DPPH free radicals of grape seed powder removed phenolic fluid

由圖5 可見，時(shí)間對不同處理方式下脫酚葡萄籽粉液對DPPH 自由基的清除率影響不顯著，且每種處理方式下的清除率均很穩(wěn)定。而且參比Ⅰ對DPPH 自由基的清除效果最差，清除率約為35%左右，參比Ⅲ的清除率約為40%，而參比Ⅱ和發(fā)酵液對DPPH 自由基的清除率相對較高分別為61.91% 和85.11%。結(jié)合圖1、圖2 可知，堿性蛋白酶水解葡萄籽粉得到的多肽類物質(zhì)可能是清除DPPH 自由基的主要物質(zhì)之一，但脫酚葡萄籽粉水溶性成分以及通過堿性蛋白酶和地衣芽孢桿菌發(fā)酵后的非多肽類物質(zhì)的作用也不能忽視。

3 討論與結(jié)論

孫蕓等［16］認(rèn)為，葡萄籽原花青素對DPPH·的清除作用與聚合度無關(guān)，對·OH 和超氧陰離子自由基的清除能力隨著聚合度的升高而下降。張玲［19］認(rèn)為，小麥蛋白的酶解多肽類物質(zhì)對DPPH·、羥基和超氧陰離子自由基的清除能力隨多肽分子量的減小而增加，隨多肽濃度的增加而增加，分子量小于3000u 的肽片段抗氧化效果最好。鄧成萍［20］等人研究了大豆蛋白酶解產(chǎn)物不同分子量肽段的抗氧化性也得到類似的結(jié)論。實(shí)驗(yàn)中對發(fā)酵液采用凝膠電泳定性測定了多肽類物質(zhì)的分子量范圍，在小于21ku 有多條條帶?？赏茰y，本研究脫酚葡萄籽粉發(fā)酵液清除自由基的差異與發(fā)酵液中肽段的分子量偏大以及脫酚后殘余原花青素的聚合度有關(guān)。但具體原因還有待于進(jìn)一步研究。

由此，先培養(yǎng)地衣芽孢桿菌使其繁殖和產(chǎn)堿性蛋白酶達(dá)到一定程度后，加入一定固液比的脫酚葡萄籽粉的處理方式，得到多肽量最大為4.23g/L。而且通過地衣芽孢桿菌發(fā)酵和堿性蛋白酶的作用，葡萄籽粉組織內(nèi)的多酚類物質(zhì)會釋放出來，最高可達(dá)128.83mg/L，但隨時(shí)間延長，多酚類物質(zhì)量有所降低。脫酚葡萄籽粉水解后的多肽類物質(zhì)對羥自由基和DPPH 自由基的清除起關(guān)鍵作用，而且可能得到的是不同分子量的多肽物質(zhì)，不同片段的多肽物質(zhì)對自由基的清除效果不同。脫酚葡萄籽粉中的原花青素以及白藜蘆醇等成分在清除超氧陰離子自由基方面發(fā)揮主要作用，但堿性蛋白酶和地衣芽孢桿菌對葡萄籽粉的作用使其對超氧陰離子自由基的清除效果提高了約20%。

［1］張美莉，侯文娟，楊立風(fēng).植物蛋白源生物活性肽的研究進(jìn)展［J］.中國食品與營養(yǎng)，2010(11):34-36.

［2］張莉莉，嚴(yán)群芳，王恬，等.大豆生物活性肽的分離及抗氧化活性的研究［J］.食品科學(xué)，2007，28(5):208-211.

［3］Folawiyo Y L，Owusu Apenten R K.The effect of heat and acid treatment on the structure of rape seed albumin(napin)［J］.Food Chemistry，1997，58(3):237-243.

［4］Chabanon G，Chevalot I，F(xiàn)ramboisier X，et al.Hydrolysis of rapeseed protein isolates:Kinetics characterization and functional properties of hydrolyates［J］.Process Biochemistry，2007，42:1419-1428.

［5］邱鑫，肖漢乾，向天勇，等.菜籽餅粕粗蛋白降解菌的篩選、初步鑒定與發(fā)酵條件摸索［J］.氨基酸和生物資源，2005，27(1):1-5.

［6］葉潤，牟德華.葡萄籽中多酚類物質(zhì)的脫除及蛋白質(zhì)提取實(shí)驗(yàn)研究［J］.食品研究與開發(fā)，2009，30(12):45-48.

［7］Rambourg J C，Monties B. Determination of polyphenolic compounds in leaf protein concentrates of lucerne and their effect on the nutritional value［J］.Plant Foods for Human Nutrition，1983，33(2):169-172.

［8］魯偉，任國譜，宋俊梅.蛋白水解液中多肽含量的測定方法［J］.食品科學(xué)，2005，26(7):169-171.

［9］王永寧，石玉平，郭珍，等.沙棗花中黃酮類化合物對羥基自由基的清除研究［J］.青海醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，24(4):281-283.

［10］程超，李偉，汪興平.平菇水溶性多糖結(jié)構(gòu)表征與體外抗氧化作用［J］.食品科學(xué)，2005，26(8):55-56.

［11］Liu X L，Cui Ch，Zhao M M，et al.Identification of phenolics in the fruit of emblica (Phyllanthus emblica L.)and their antioxidant activityes［J］.Food Chemistry，2008，109 (4):905-915.

［12］熊何健，吳國宏，王莉芳，等.山竹多酚的分離制備及清除自由基活性研究［J］.河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2010，31(5):25-29，70.

［13］Pena-Ramos E A，Xiong Y L.Antioxidantive activity of whey protein hydrolysates in a liposomal system［J］.Journal of Dairy Science，2001，84(12):2577-2583.

［14］郭紅英.麥胚蛋白酶解物的制備及其抗氧化性研究［D］.鎮(zhèn)江:江蘇大學(xué)，2009.

［15］楊碧霞，馮翠萍，張碩，等.葡萄籽多肽的制備及功能研究［J］.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2010，31(6):551-556.

［16］孫蕓，徐寶才，谷文英，等.葡萄籽原花青素聚合度與自由基清除能力關(guān)系的研究［J］.食品科學(xué)，2007，28(12):423-428.

［17］鐘耕，陳宗道，閡燕萍.葡萄籽和皮中黃酮成分和抗氧化能力研究［J］.西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2005，27(1):64-68.

［18］李姣娟，周盡花，戴瑜，等.川桂葉總黃酮清除DPPH 自由基作用的研究［J］.中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，30(10):125-128，132.

［19］張玲.小麥面筋多膚的分離純化及抗氧化活性測定［D］.鎮(zhèn)江:江蘇大學(xué)，2010

［20］鄧成萍，薛文通，孫曉琳，等.不同分子量段大豆多肽功能特性的研究［J］.食品科學(xué)，2006，27(5):109-112.