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      鰱魚CPIs 的三種電泳鑒定方法的比較研究

      2013-08-07 09:13:46李樹紅任陽(yáng)陽(yáng)李艷芳彭海鑫
      食品工業(yè)科技 2013年21期
      關(guān)鍵詞:下腳料鰱魚泳道

      李樹紅,任陽(yáng)陽(yáng),+,李艷芳,彭海鑫,曹 坤,李 冉,蘇 趙

      (1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,四川雅安625014;2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,四川雅安625014)

      我國(guó)水域資源遼闊,魚類種類資源豐富,其中鰱魚是我國(guó)主要淡水養(yǎng)殖品種之一,年產(chǎn)量371.39 萬(wàn)噸,位居第二[1]。魚類下腳料中含有豐富半胱氨酸蛋白酶抑制因子(cysteine protease inhibitors),簡(jiǎn)稱CPIs[2]。隨著對(duì)CPIs 的不斷深入研究,發(fā)現(xiàn)其在細(xì)胞凋亡、腫瘤的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移、臨床診斷、抗蟲、抗病毒、抗菌以及肉質(zhì)等方面都起著非常重要的作用[3]。因此,有必要對(duì)鰱魚下腳料中CPIs 進(jìn)行分離提取,以便充分開發(fā)和利用我國(guó)淡水鰱魚資源。目前作者所在研究團(tuán)隊(duì),首次對(duì)鰱魚下腳料中小分子CPIs 進(jìn)行了分離純化鑒定[4]。但在研究過程中發(fā)現(xiàn),鰱魚某些下腳料中CPIs 在初分離階段,不易檢測(cè)到抑制活性,為純化工作帶來(lái)困難,需要借助其他手段進(jìn)行鑒定。然而目前常用于鑒定CPIs 的方法,大部分主要基于免疫反應(yīng)的原理,即單向免疫擴(kuò)散法(RID)[5]、放射免疫測(cè)定法(RIA)[6]、熒光免疫測(cè)定法(FIA)[7]等,這些方法都需要制備抗體,過程繁瑣,成本昂貴,不適層析純化過程中鰱魚CPIs 的快速鑒定,為此,確立一種方便準(zhǔn)確的電泳方法鑒定鰱魚粗提組分中CPIs,不僅利于分離純化工作的順利進(jìn)行,而且對(duì)于分析判斷其他魚類各下腳料中的CPIs 活性成分的分布情況,同樣具有借鑒意義。本文主要對(duì)三種CPIs 的電泳鑒定方法進(jìn)行了比較分析,以便確定最適于鑒定鰱魚下腳料粗提樣中CPIs 的靈敏度高且分辨效果最佳的電泳鑒定方法,以彌補(bǔ)以明膠為底物的非還原SDS-PAGE 反相酶譜在實(shí)際應(yīng)用中存在的不足。

      1 材料與方法

      1.1 材料與儀器

      鰱魚下腳料 于四川崇州通威養(yǎng)殖中心采樣;懷卵期(IV 期)鰱魚,宰殺后,立即采卵、肝胰組織,樣品液氮速凍后于-80℃超低溫冰箱凍藏,使用前4℃解凍。

      木瓜蛋白酶(papain)(P4762,10U/mg)、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、SDS、牛血清白蛋白、細(xì)胞色素C、DMSO、AMC、Z-Phe-Arg-MCA、偶氮酪蛋白(Azocasein) 美國(guó)Sigma 公司;TEMED 美國(guó)Bio-Rad;DTT 美國(guó)BBI;中分子量(Marker 14.4 ~94ku) 北京天根;中分子量Marker(14.4~97.4ku)美國(guó)Promega;蛋白濃度試劑盒 南京建成。

      Ultra-stirred cell 8050 超濾杯 美國(guó)Millipore;LRH-250 生化培養(yǎng)箱 上海一恒;Mapada V-1200可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá);Mini Protein3 垂直電泳槽、JY-ECP3000 電泳儀、Dio-Gel-2000 凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad。

      1.2 實(shí)驗(yàn)方法

      1.2.1 鰱魚下腳料CPIs 粗提樣品的制備 鰱魚卵CPIs 粗提樣:鰱魚卵經(jīng)粗提液勻漿、酸處理后,用30ku 超濾膜超濾,取下清,再經(jīng)3ku 超濾濃縮,制得鰱魚卵小分子CPIs 濃縮粗提液。

      鰱魚肝胰粗提樣:鰱魚肝胰經(jīng)勻漿、堿化處理后,立即用冰醋酸回調(diào),此后30%~80%硫酸銨分段鹽析。透析后經(jīng)3ku 超濾濃縮制得鰱魚肝胰CPIs 濃縮粗提液。

      1.2.2 蛋白濃度的測(cè)定 參照Bradford[8]法,按照蛋白濃度試劑盒說明測(cè)定所用樣品的蛋白濃度。

      1.2.3 CPIs 抑制活性的測(cè)定 熒光合成肽底物法:通過熒光合成肽底物法[9]檢測(cè)CPIs 粗提樣對(duì)papain的抑制活性。一個(gè)酶活單位定義為:在40℃、pH6.8的反應(yīng)條件下,能夠在1min 內(nèi)水解底物并釋放出1nmol AMC 產(chǎn)物的酶活性量(1nmol AMC/min)。一個(gè)抑制活性單位定義為:抑制一個(gè)單位的酶活性。

      偶氮酪蛋白(Azocasein)法:鰱魚CPIs 粗提液抑制活性的另一種測(cè)定方法Azocasein 法參考本實(shí)驗(yàn)室前期方法[9]。通過調(diào)節(jié)CPIs 的用量,使其抑制木瓜蛋白酶的Azocasein 水解活性的抑制比率在30% ~70%之間。CPIs 的一個(gè)抑制活性單位定義為:在37℃的反應(yīng)條件下,440nm 處降低0.01 個(gè)吸光度即為一個(gè)單位。

      1.2.4 CPIs 的三種電泳鑒定方法 本實(shí)驗(yàn)主要采用三種電泳方法對(duì)鰱魚下腳料粗提樣中CPIs 進(jìn)行鑒定。方法A:基本參照Li[10]的反相酶譜電泳法;方法B:Native-PAGE 反相酶譜電泳法;方法C:與papain反應(yīng)后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳法。具體操作過程和不同之處如下。

      1.2.4.1 電泳緩沖液的配制方法 方法A 和方法C的5 × 電泳緩沖液(室溫保存):120mmol/L Tris,95mmol/L Gly,0.5% SDS pH8.3。方法B 電泳緩沖液:25mmol/L 的 Tris,192mmol/L 的 甘 氨 酸,pH8.8[11]。方法A 和方法C 的分離膠緩沖液為溶解120mmol/L Tris,0.1% SDS,60mmol/L 硼酸,pH8.9,濃縮膠緩沖液為1.0mol/L Tris-HCl,10%(w/v)SDS,pH6.8;方法B 的分離膠緩沖液為1.5mol/L Tris pH為8.8,濃縮膠緩沖液0.5mol/L Tris pH 為6.8。

      1.2.4.2 電泳樣品的制備 方法A 和方法B 中要保持樣品的活性,因此在樣品制備時(shí)使用不含還原劑(β-巰基乙醇)的樣品緩沖液,其中方法A 的2 ×樣品緩沖液為2mL 的0.5mol/L Tris - HC 緩沖液(pH6.8),2mL 甘油,2mL 的20%的SDS,0.5mL 1%溴酚藍(lán),3.5mL 蒸餾水。方法B 5 × 樣品緩沖液為3.1mL 1mol/L Tris-HCl(pH6.8),5mL 甘油,0.5mL 1%溴酚藍(lán),1.4mL 蒸餾水。方法C 與方法A 除樣品緩沖液中含0.1%的β-巰基乙醇外,其他相同。

      方法A 和方法B 中樣品處理時(shí),樣品與樣品緩沖液分別于1∶1 和4∶1 混合后,進(jìn)行電泳。方法C 樣品處理時(shí)首先要確定反應(yīng)體系中papain 用量,將2.5μg 的BSA 分別與0.625、1.25、2.5μg 的papain(濃度為1.25mg/mL)混合均勻后,于37℃水浴反應(yīng)1h和5h。反應(yīng)完后根據(jù)管里剩余反應(yīng)液體積,按等比例加方法C 樣品緩沖液,然后加熱煮沸5min,進(jìn)行電泳。

      1.2.4.3 電泳條件 方法A 和方法C 使用17%的分離膠,而方法B 使用8%的分離膠,電泳均采用100V恒壓,電泳時(shí)間約2h。

      1.2.4.4 電泳結(jié)束后凝膠的反相酶譜處理方法 方法A:凝膠用30mL 含2.5% Triton X-100 的復(fù)性緩沖液于搖床洗3 次,每次15min,將凝膠中的SDS 洗掉。然后用超純水清洗凝膠2~3 次;復(fù)性后的凝膠用15mL 含0.4mg/mL 的papain 的50mmol 的磷酸鹽緩沖液(pH7.0)在4℃反應(yīng)1h;取出凝膠再用15mL,含1% 明膠的50mmol 的磷酸鹽緩沖液(pH7.0)在37℃反應(yīng)8h。方法B:用30mL 含1mmol/L 的DTT的雙蒸水于搖床洗3 次,每次15min。然后用15mL含0.4mg/mL 的papain 的50mmol 的磷酸鹽緩沖液(pH7.0)在4℃反應(yīng)1h;用15mL 含1% 明膠的50mmol 的磷酸鹽緩沖液(pH7.0)在37℃浸泡8h。方法C:未進(jìn)行反相酶譜處理。

      1.2.4.5 膠的固定染色和脫色 三種方法均用考馬斯亮藍(lán)R-250 染色液(考馬斯亮藍(lán)0.1%,乙醇40%,冰醋酸10%)染色1h。而后用脫色液(95%乙醇∶冰醋酸∶蒸餾水=4.5∶0.5∶5)脫色至電泳背景色消失,電泳帶清晰可見。

      表1 鰱魚卵、肝胰濃縮粗提液CPIs 抑制活性測(cè)定Table 1 The inhibitive activities of CPIs in the concentrated crude extract from Silver Carp eggs and hepatopancreas

      1.2.4.6 分子量分析 用Quantity One 電泳圖像分析軟件(Bio-Rad)分析CPIs 的分子量。

      2 結(jié)果與討論

      2.1 鰱魚卵、肝胰濃縮粗提液中CPIs 抑制活性測(cè)定

      由表1 可知,與鰱魚卵濃縮粗提液相比,鰱魚肝胰濃縮粗提液中CPIs 抑制活性,采用熒光底物法及Azocasein 法兩種方法均檢測(cè)不出,可能是肝胰組織中胰蛋白酶和半胱氨酸組織蛋白酶等含量較豐富,干擾抑制活性測(cè)定。此外,本實(shí)驗(yàn)中作為對(duì)照蛋白的細(xì)胞色素C、牛血清白蛋白BSA 也無(wú)抑制活性。

      2.2 Geltain-substrate-SDS-PAGE 反相酶譜法鑒定CPIs

      盡管利用熒光底物法和azocasein 法都能夠測(cè)得鰱魚濃縮粗提液中CPIs 的抑制活性,但在利用方法A 的反相酶譜電泳鑒定(圖1)中,與對(duì)照(1 泳道)相比,鰱魚卵濃縮粗提液(3 泳道),幾乎全部被papain水解,無(wú)抑制條帶出現(xiàn)。這可能是由于鰱魚CPIs 活性/比活性較低(均比草魚低約50 倍,資料未發(fā)表),而A 法中,聚丙烯酰胺凝膠需在含有1%的明膠中浸泡,膠背景偏深,因此即使粗提樣品中存在少量低活性的沒有被papain 水解的鰱魚CPIs,也很難在電泳膠上觀察到。同時(shí)也很可能是A 法中所用的非離子型去垢劑SDS 導(dǎo)致鰱魚CPIs 結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,致使其失活。研究表明鯉魚小分子Cystatin(CPI 中的一種)表面均勻分布正電荷[12],帶負(fù)電荷的SDS 很可能導(dǎo)致其構(gòu)象改變進(jìn)而喪失抑制活性。

      圖1 鰱魚卵濃縮粗提樣中CPIs 的明膠-底物-SDS-PAGE 反相酶譜鑒定Fig.1 The Geltain-substrate-SDS-PAGE reverse zymography of silver carp egg coarse extract

      此外,盡管對(duì)照蛋白細(xì)胞色素C 沒有papain 抑制活性,但由于電泳上樣濃度高(2 泳道),且papain用量或反應(yīng)時(shí)間不足,經(jīng)反相酶譜處理后(4 泳道),該蛋白仍沒有完全水解,還有部分條帶清晰可見,這會(huì)導(dǎo)致抑制劑鑒定時(shí)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。因此,推測(cè)如果待檢樣品中存在高濃度雜蛋白時(shí),很可能也會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性。綜上分析,一方面說明,利用A 法的反相酶譜法鑒定抑制劑,尤其待測(cè)抑制劑活性較低或在電泳上易于失活時(shí),為避免誤判,設(shè)立對(duì)照蛋白十分必要。另一方面也說明,A 法在鑒定結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定、活性低的抑制劑時(shí)具有局限性,A 法不適合鑒定鰱魚下腳料中的CPIs。

      2.3 Native-PAGE 反相酶譜電泳法鑒定CPIs

      利用Native-PAGE 反相酶譜法(B 法)鑒定鰱魚卵濃縮粗提液中CPIs(圖2),發(fā)現(xiàn),鰱魚卵濃縮粗提液上樣濃度(泳道2)遠(yuǎn)低于CPIs 的對(duì)照蛋白BSA(泳道1),但在經(jīng)反相酶譜處理后鰱魚卵濃縮粗提液(泳道4)中條帶與其對(duì)照(泳道2)相比,幾乎沒有被papain 水解,目的條帶(箭頭所示)清晰可見;同時(shí),BSA 被反相酶譜處理過程中的papain 水解殆盡(泳道3),也沒有出現(xiàn)假陽(yáng)性。用不含SDS 的Native-PAGE 反相酶譜法(B 法)鑒定鰱魚卵小分子CPIs 濃縮粗提物時(shí),CPIs 較好地保持了原有抑制活性,這進(jìn)一步證明了帶負(fù)電荷的SDS 小分子CPIs 結(jié)構(gòu)和活性的可能影響作用,也說明很可能鰱魚卵小分子Cystatin 表面也存在正電荷。同時(shí)發(fā)現(xiàn),B 法靈敏度高,清晰準(zhǔn)確地鑒定了鰱魚下腳料中小分子CPIs。但B 法主要是根據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷分離蛋白質(zhì),雖然可以鑒定CPIs 存在,但不能像A 法那樣準(zhǔn)確反映分子量大小。不過可以通過電洗脫等方式回收有活性的CPIs 蛋白后,再進(jìn)行分子量鑒定,步驟相對(duì)繁瑣??傊瑢?duì)于電泳上結(jié)構(gòu)或活性不穩(wěn)定的CPIs,B法是一種比較理想的鑒定方法,因此非常適合鰱魚卵粗提取樣中小分子CPIs 的鑒定。

      2.4 與papain 反應(yīng)后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳鑒定

      2.4.1 papain 水解BSA 的反應(yīng)條件確定 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了采用CPIs 的對(duì)照蛋白,即2.5μg 的BSA 與不同量的papain(E-64 滴定法確定其1.25mg/mL 時(shí)有效濃度為6.05μmol/L,資料未發(fā)表)于37℃進(jìn)行水解反應(yīng),分別于1、5h 取樣,檢測(cè)BSA 的水解情況,以便確定papain 可以完全水解掉BSA 的反應(yīng)條件,進(jìn)而將該確定的條件應(yīng)用于鰱魚CPIs 粗提取樣品。

      圖2 鰱魚卵濃縮粗提液中CPIs 的Native-PAGE 反相酶譜鑒定Fig.2 The Native-PAGE Reverse zymographic of the samples from silver carp egg coarse extract

      由圖3 可見,當(dāng)反應(yīng)1h 和5h 時(shí),0.625、1.25、2.5μg 的papain,均可以將2.5μg 的BSA 徹底水解,但是0.625μg 的papain 水解1h(泳道8),仍可見微量的BSA 降解后形成的彌散條帶。同時(shí)當(dāng)papain 用量為1.25、2.5μg 時(shí),泳道上出現(xiàn)明顯的papain 蛋白條帶(如箭頭所示),可能會(huì)干擾后續(xù)實(shí)驗(yàn)中對(duì)抑制劑條帶的判斷。因此,確定徹底水解2.5μg BSA 的適宜條件為,papain 用量0.625μg,37℃反應(yīng)至少5h以上。

      圖3 papain 水解牛血清白蛋白效果的SDS-PAGEFig.3 The SDS-PAGE of hydrolysis effect of bovine serum albumin by papain

      2.4.2 CPIs 濃縮粗提液與papain 反應(yīng)后的SDSPAGE 鑒定 由圖4 分析可知,當(dāng)鰱魚卵濃縮粗提樣(2.5μg)與0.625μg 的papain 于37℃反應(yīng)15h 后,其中的非目的蛋白幾乎全部水解,唯具有活性的約16ku 和7ku 目的蛋白條帶(如箭頭所示)保留。樣品先與papain 直接反應(yīng),而后進(jìn)行SDS-PAGE 鑒定(C法),這樣避免了樣品中小分子CPIs 在含有SDS 的電泳上失活的缺點(diǎn),既保持并體現(xiàn)了粗提液中CPIs的抑制活性,又通過電泳分離,清晰可見抑制條帶。因此,C 法是一種很理想的鑒定方法,不僅靈敏度高,鑒定效果好,同時(shí)亦可準(zhǔn)確反映分子量的大小,可協(xié)同B 法充分鑒定鰱魚CPIs。

      2.5 鰱魚肝胰粗分離樣品中CPIs 的鑒定

      圖4 粗提樣與papain 反應(yīng)后再進(jìn)行SDS-PAGE 電泳鑒定Fig.4 The SDS-PAGE of CPIs in the silver carp egg coarse extract after hydrolysis by papain

      由圖5 可見,盡管用熒光底物法和azocasein 法均檢測(cè)不到肝胰粗分離樣品中的CPIs 抑制活性,但是C 法則可以有效判斷CPIs 的存在,分子量分布情況(約97、23、16、7ku),如箭頭所示,其中約97ku 的高分子量CPI 同樣得到了鑒定。因此,本實(shí)驗(yàn)利用C法,均較理想地鑒定了不便測(cè)活的鰱魚肝胰濃縮粗提液中CPIs 的存在和分子量分布。

      圖5 papain 不水解CPIs 電泳Fig.5 The electrophoresis of papain not hydrolysis CPIs

      3 結(jié)論

      我國(guó)淡水鰱魚資源豐富,對(duì)其下腳料中含量豐富、具有多種生理活性的CPIs 進(jìn)行分離提取和鑒定,對(duì)于充分開發(fā)利用此資源具有重要意義。因此,針對(duì)鰱魚下腳料粗提組分CPIs,確立方便、準(zhǔn)確的電泳鑒定方法,在分離純化工作中尤為重要。

      本研究通過對(duì)三種CPIs 的電泳鑒定方法進(jìn)行比較研究,發(fā)現(xiàn)對(duì)于抑制劑活性較低或在電泳上容易失活的鰱魚卵小分子CPIs,研究工作中通常采用的以明膠為底物的非還原SDS-PAGE 反相酶譜(A 法)不僅不適宜,而且樣品中存在高濃度雜蛋白時(shí),很可能也會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性,在實(shí)際應(yīng)用中存在局限性和不足;Native-PAGE 反相酶譜法(B 法)雖然靈敏度高,清晰準(zhǔn)確,但不能直接反映分子量大小;樣品先與papain 直接反應(yīng),而后進(jìn)行SDS-PAGE 鑒定(C 法),靈敏度高,既保持并體現(xiàn)了粗提液中CPIs 的抑制活性,又通過電泳分離,使得抑制條帶清晰可見。因此,C 法或者協(xié)同B 法,是鑒定鰱魚下腳料粗提液中CPIs 的理想、有效方法。此外,本研究也說明,在對(duì)蛋白性抑制劑進(jìn)行電泳鑒定時(shí),需要根據(jù)抑制劑的活性、電泳穩(wěn)定性等實(shí)際情況,分析判斷,選擇合理的電泳鑒定方法。

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