肌酐代謝產(chǎn)物對腎小管上皮細胞凋亡的影響

胡白瑛

（柳州市柳鐵中心醫(yī)院腎內(nèi)科，廣西柳州545007）

肌酐代謝產(chǎn)物對腎小管上皮細胞凋亡的影響

胡白瑛

（柳州市柳鐵中心醫(yī)院腎內(nèi)科，廣西柳州545007）

目的研究肌酐產(chǎn)物是否能促進腎小管上皮細胞凋亡。方法原代培養(yǎng)人腎小管上皮細胞，將肌酐產(chǎn)物與腎小管上皮細胞共同培養(yǎng)，對腎小管上皮細胞進行形態(tài)學觀察；抽提DNA進行瓊脂糖電泳觀察有無梯形條帶。結(jié)果腎小管上皮細胞在肌酐產(chǎn)物作用下逐漸變小、變圓、固縮，最后漂浮死亡，但胞膜始終完整；肌酐產(chǎn)物導致腎小管上皮細胞凋亡，瓊脂糖凝膠中有DNA梯形條帶，加入谷胱甘肽(GSH)未見DNA梯形條帶。結(jié)論肌酐產(chǎn)物促進腎小管上皮細胞凋亡，GSH可阻斷之。

肌酐產(chǎn)物；腎小管上皮細胞；凋亡

慢性腎功能不全進行性惡化的主要病理基礎(chǔ)一直被認為是腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化。近年來發(fā)現(xiàn)腎臟細胞調(diào)亡也是加劇腎功能不全的主要因素，但誘發(fā)細胞調(diào)亡及其環(huán)節(jié)尚不清楚。本文以肌酐代謝產(chǎn)物對腎小管上皮細胞的作用，觀察是否有誘發(fā)調(diào)亡的作用。

1 材料與方法

1.1 材料(1)原代培養(yǎng)的人腎小管上皮細胞；(2)分解肌酐能力最強的尿毒癥患者腸道之肺炎克雷伯氏菌；(3)肌酐。

1.2 方法(1)取含0.14 mg/ml肌酐的無蛋白培養(yǎng)液1 ml于Eppendoff管中，每管中加入1菌環(huán)肺炎克雷伯氏菌，放入37℃恒溫箱培養(yǎng)48 h，然后離心取上清液，矯正pH后過濾除菌，作為肌酐產(chǎn)物備用。在腎小管上皮細胞傳代第5 d后，用上清液與完全培養(yǎng)液以1/9的比例混合的混合液代替完全培養(yǎng)液，于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。加入谷胱甘肽做為對照組。(2)收集培養(yǎng)了2 d、3 d、4 d、5 d、6 d的腎小管上皮細胞及對照組的腎小管上皮細胞，細胞數(shù)106個，將細胞溶解在裂解液中，37℃保溫18 h以上，再用飽和苯酚、氯仿、異戊醇抽提上清液2次，經(jīng)乙醇-20℃沉淀后，離心30 min，再用適量的TE溶解，加RNase酶5 mg/L，37℃溫育1 h，降解RNA后，在加入溴化乙錠的1.6%瓊脂糖凝膠上電泳，紫外燈下觀察梯形條帶并成像。

2 結(jié)果

2.1 肌酐產(chǎn)物作用下的腎小管上皮細胞肌酐產(chǎn)物組的腎小管上皮細胞12 h出現(xiàn)形態(tài)改變，細胞有較多空泡產(chǎn)生，由扁平伸展逐漸變小變圓，細胞逐漸固縮，但胞膜完整，最后第7天全部脫落懸浮。對照組僅產(chǎn)生少量氣泡，無其他表現(xiàn)，見圖1～圖3。

圖1 加入肌酐產(chǎn)物48 h的腎小管上皮細胞（光鏡×400）

圖2 加入肌酐96 h的腎小管上皮細胞（光鏡×400）

圖3 加入肌酐7 d的腎小管上皮細胞(光鏡×400)

2.2 凋亡的腎小管上皮細胞的梯形條帶第一泳道為加入肌酐產(chǎn)物第4天的腎小管上皮細胞中抽提的DNA。第二泳道為100 bp DNA Ladder marker，自下而上依次為100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp、700 bp、800 bp、900 bp、1 000 bp、1 500 bp。第三泳道為加入GSH的對照組。見圖4

圖4 瓊脂糖電泳DNA梯形條帶

3 討論

本實驗發(fā)現(xiàn)肌酐代謝產(chǎn)物對腎小管上皮細胞的影響出現(xiàn)了以下特點：加入肌酐產(chǎn)物1 d起細胞就開始有變化，1～2 d內(nèi)細胞內(nèi)出現(xiàn)大量空泡，第4天細胞明顯變小、變圓，繼而出現(xiàn)細胞核固縮，但胞膜完整，最后細胞漂浮死亡。符合凋亡的特征。

對細胞凋亡機制的研究表明，半胱氨酰天冬酸特異性蛋白-3(Caspase-3)激活的絲氨酸蛋白-凋亡蛋白酶(AP24)誘導凋亡時細胞核DNA鏈的碎裂。DNA鏈碎裂系激活細胞核內(nèi)的核酸限制性內(nèi)切酶，使染色體有控降解，DNA在核小體間被切成180～200 bp及其倍數(shù)的核苷酸片段，在瓊脂糖電泳上呈現(xiàn)特征性的梯形條帶。在本實驗中我們在不同時段收集細胞進行DNA抽提，并進行瓊脂糖電泳，出現(xiàn)了DNA梯形條帶，其中以第4天最為明顯。說明細菌作用于肌酐的代謝產(chǎn)物確實可引起腎小管上皮細胞的凋亡。實驗中加入GSH的第3泳道未出現(xiàn)DNA梯形條帶，說明GSH可以預防細菌作用于肌酐的代謝產(chǎn)物引起的腎小管上皮細胞的凋亡。

GSH抗細胞凋亡可能與下列環(huán)節(jié)有關(guān)：(1)GSH含量降低是一種潛在的凋亡早期激活信號。研究認為氧化應(yīng)激狀態(tài)下，隨著活性氧產(chǎn)生的增加，細胞內(nèi)GSH含量降低[1]，在外部凋亡刺激的情況下誘發(fā)了多種凋亡信號的產(chǎn)生；3 h后可見NFκB(轉(zhuǎn)錄因子κ基因結(jié)合核因子)的RelA亞基的激活和核易位；24 h后一種縮短形式的p53蛋白呈時間依賴的表達；48～72 h后隨著線粒體GSH耗竭和ROS(反應(yīng)性氧類)產(chǎn)生增加,細胞產(chǎn)生了凋亡。(2)GSH耗竭，DNA易碎裂。在HL-60細胞及PW白細胞，Bcl-2(B細胞淋巴細胞/白細胞-2)基因的過度表達抑制腫瘤壞死因子及紫外線誘發(fā)的AP24蛋白酶激活，抑制細胞凋亡；但GSH耗竭及Bcl-2過度表達的細胞對腫瘤壞死因子及紫外線激活的AP24蛋白酶敏感并且產(chǎn)生凋亡；GSH耗竭時Bcl-2過度表達細胞的細胞核對AP24誘導的DNA碎裂敏感性高。

本實驗中肌酐代謝產(chǎn)物作用于腎小管上皮細胞就是使其處于氧化應(yīng)激中，消耗其GSH，使GSH含量降低，腎小管上皮細胞出現(xiàn)了凋亡，故加入GSH可防止凋亡。亦有文獻證實脂質(zhì)過氧化、活性氧、自由基均可引起腎小管上皮細胞的壞死和凋亡[2-3]。

本實驗表明細胞凋亡在慢性腎功能衰竭中扮演重要角色。肌酐產(chǎn)物通過誘導腎小管上皮細胞凋亡促進腎小管萎縮，加劇了腎功能衰竭，這是慢性腎衰腎功能惡化機制之一。氧化損傷、GSH減少是引起腎小管上皮細胞凋亡的兩個重要因素。這有助于我們尋找新的特異性的治療手段干預慢性腎功能衰竭，如抗氧化劑GSH的應(yīng)用。對Bcl 2家族和Caspase等凋亡途徑干預來治療慢性腎功能衰竭，可望在慢性腎衰進行性惡化的控制上提供新的啟示。

[1]Armstrong JS,Steinauer KK,Hornung B,et al.Role of glutathionede depletion and reactive oxygen species generation in apoptotic signalingina human B lymphoma cell line[J].Cell Death Differ, 2002,9(3):252-263

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[3]周萍，趙廣成，吳玉斌,等.氧化應(yīng)激對大鼠腎小管上皮細胞生物學行為的影響及L-EGCG的保護作用[J].醫(yī)學臨床研究,2010, 27(10):1804-1808.

Effect of metabolites of creatinine on the apoptosis of renal tubular epithelial cells.

HU Bai-ying.Department of Nephrology,Liuzhou Municipal Liutie Central Hospital,Liuzhou 545007,Guangxi,CHINA

ObjectiveTo study the effect of metabolites of creatinine on the apoptosis of renal tubular epithelial cells.MethodsRenal tubular epithelia were cultured in vitro.The metabolites of creatinine and renal tubular epithelial cells were incubated together.The morphological change of renal tubular epithelial cells was observed.Gel electrophoresis of DNA extracted from that to observe bands of apoptotsis.ResultsAffected by metabolites of creatinine,renal tubular epithelial cells showed characters of apoptosis(smaller,round,pyknosis and death),but the cell membrane was always integral.Agarose gel electrophoresis revealed the appearance of DNA ladder,which disappeared with the addition of GSH.ConclusionThe metabolites of creatinine can induce the apoptosis of renal tubular epithelial cells,which could be reversed by GSH.

Metabolite of creatinine;Renal tubular epithelial cells;Apoptosis

R334+.1

A

1003—6350（2013）09—1268—02

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.09.0536

2012-11-28)

胡白瑛。E-mail：hubaiying@sohu.com