腦鈉尿肽基因rs198389單核苷酸多態(tài)性與冠心病的相關(guān)性研究

蕾茹，江小青，汪里萍，肖衛(wèi)，劉黃軍

(荊州市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科，湖北荊州434000)

·論著·

腦鈉尿肽基因rs198389單核苷酸多態(tài)性與冠心病的相關(guān)性研究

蕾茹，江小青，汪里萍，肖衛(wèi)，劉黃軍

(荊州市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科，湖北荊州434000)

目的探討腦鈉尿肽(BNP)基因rs198389位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性(SNP)與冠心病(CHD)的關(guān)系。方法取病例-對(duì)照方法，收集冠心病和健康者各961例，應(yīng)用Real-time qPCR(TaqMan探針)技術(shù)進(jìn)行基因分型，分析BNP基因rs198389位點(diǎn)SNP與CHD危險(xiǎn)性的關(guān)系。結(jié)果CHD組和對(duì)照組比較，AA和GG基因型、A等位基因和G等位基因分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；GG基因型和G等位基因頻率在病例組(3.6%和16.7%)明顯高于對(duì)照組(2.1%和14.3%)。與A等位基因比較，G等位基因使CHD危險(xiǎn)性顯著增加(OR=1.20，95%CI=1.01～1.43，P=0.04)。GG基因型者CHD危險(xiǎn)性增加(P=0.04)，但在調(diào)整年齡、性別、吸煙、飲酒、體重指數(shù)、血甘油三脂、高血壓史、糖尿病史和CHD家族史等變量后結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.12)。結(jié)論BNP基因位點(diǎn)rs198389的G等位基因使CHD危險(xiǎn)性顯著增加；BNP基因rs198389位點(diǎn)SNP可能與CHD易感性相關(guān)，但不是其獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

腦鈉尿肽；單核苷酸多態(tài)性；冠心病

冠心病(CHD)的發(fā)生與基因遺傳易感性有關(guān)。腦鈉尿肽(BNP)有維持機(jī)體循環(huán)系統(tǒng)和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用，通過(guò)多種機(jī)制參與CHD的發(fā)生發(fā)展，BNP基因可能成為一種與CHD危險(xiǎn)相關(guān)的候選基因。本研究對(duì)BNP基因的rs198389位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性(SNP)與CHD的關(guān)系進(jìn)行初步探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料研究采用病例-對(duì)照設(shè)計(jì)。病例組和對(duì)照組各961例，為湖北地區(qū)無(wú)血緣關(guān)系的漢族人群。采用修訂后的Inter-heart調(diào)查表進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，所有研究對(duì)象均簽署了知情同意書(shū)。CHD診斷依據(jù)WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]或經(jīng)冠脈造影顯示有一支或一支以上冠脈狹窄≥50%者(CHD組)。對(duì)照組為常規(guī)體檢健康者。心血管危險(xiǎn)因素判斷：高血壓[收縮壓≥140 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)和(或)舒張壓≥90 mmHg或目前正在服用降壓藥物]、糖尿病(空腹血糖≥7.0 mmol/L，餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L或目前在服用降糖藥物)、CHD家族史(父母中有CHD患者)、吸煙(平均每天至少吸1支，并且連續(xù)吸煙≥1年，包括現(xiàn)在吸煙或以前吸煙但已經(jīng)戒煙達(dá)到一年以上者)、體重指數(shù)(體重指數(shù)=體重(kg)/身高(m)2，19～24為正常)。

1.2 方法

1.2.1 臨床參數(shù)檢測(cè)每位對(duì)象均于空腹12 h后抽取外周靜脈血，全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、空腹血糖和肌酐。

1.2.2 基因擴(kuò)增和分型抽取外周靜脈血6 ml，注入EDTA-K2抗凝離心管，搖勻。按PUREGENE DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA抽提。測(cè)定和稀釋(GENTRA公司Puregene試劑盒)DNA至終濃度為5～10 ng/μl?；蚍中筒捎肦eal-time qPCR技術(shù)，探針(TaqMan探針)、引物和基因分型試劑盒由ABI公司提供，按公司推薦的反應(yīng)體系和條件在ABI-7900熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR和終點(diǎn)讀板分析。Rs198389位點(diǎn)2條探針?lè)謩e由FAM和VIC這2種熒光標(biāo)記，上游引物序列5'-GTCTCCCGCTTCTTCCTTTCC-3'，下游引物序列5'-CAGGAAGAAAGCGCCAACCTA-3，探針序列為FAM-AAATGTCCGGGTGTCC-NFQ，VIC-CAAATGTCCAGGTGTCC-NFQ。A等位基因由VIC(綠色)熒光標(biāo)記，G等位基因由FAM(紅色)熒光信號(hào)標(biāo)記，兩個(gè)反應(yīng)體系中均以ROX(黃色)熒光為參比。綠色曲線表示純合子AA基因型，紅色曲線表示純合子GG基因型，綠色和紅色雙曲線表示雜合子AG基因型。不同基因型的聚類(lèi)分析：紅色表示AA基因型，蘭色表示GG基因型，綠色表示AG基因型。利用SDS 2.2.1軟件分析TaqMan基因分型結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS10.0軟件包統(tǒng)計(jì)分析。在本研究中所有計(jì)數(shù)資料用卡方檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示，用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較，首先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，以P＞0.05為方差齊性，進(jìn)行t檢驗(yàn)，方差不齊者采用非參數(shù)檢驗(yàn)。采用非條件Logistic回歸模型判斷CHD危險(xiǎn)因素作用的大小?；祀s因素的控制采用多元逐步Logistic回歸模型分析，計(jì)算主要危險(xiǎn)因素的調(diào)整OR和95%CI。以O(shè)R的95%CI不包含1為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床資料比較CHD組男性693例，女性268例，平均年齡(59.73±10.13)歲；對(duì)照組男性673例，女性288例，平均年齡(59.73±9.78)歲，兩組間年齡和性別比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CHD組中吸煙、空腹血糖、收縮壓水平、高血壓史、糖尿病史和CHD家族史顯著高于對(duì)照組，而飲酒史顯著低于對(duì)照組，見(jiàn)表1。兩組舒張壓[(81.67±14.33)mmHg和(82.20±11.00)mmHg]和體重指數(shù)[(24.31±3.58)和24.30±3.24)]比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。總膽固醇水平對(duì)照組明顯高于CHD組[(5.07±1.31)mmol/L和(4.48±1.02)mmol/L，P＜0.05]，甘油三酯在兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(1.70±1.1)mmol/L和(1.70± 1.37)mmol/L，P＞0.05]，這可能與CHD組使用他汀類(lèi)調(diào)脂藥治療干預(yù)有關(guān)。

2.2 兩組基因型和等位基因頻率分布經(jīng)卡方檢驗(yàn)，各基因型在總?cè)巳骸HD組和對(duì)照人群中的分布均符合Hardy-Weinberg平衡規(guī)律(χ2值分別為1.16、1.57和0.00，P值分別為0.56、0.455和1.00)，說(shuō)明本試驗(yàn)人群的rs198389基因分布可反映整體人群的基因分布情況。總研究人群基因分布與美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)公共數(shù)據(jù)庫(kù)提供的中國(guó)人群基因分布數(shù)據(jù)對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。在CHD組和對(duì)照組之間，AA和GG基因型分布、A等位基因和G等位基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中，GG基因型和G等位基因頻率在CHD組明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，見(jiàn)表2。

表1 CHD組和對(duì)照組心血管危險(xiǎn)因素比較

表2 兩組rs198389基因型和等位基因分布[例(%)]

2.3 BNP基因rs198389多態(tài)性與CHD的關(guān)聯(lián)性采用非條件Logistic回歸分析。與A等位基因相比，G等位基因使CHD危險(xiǎn)顯著增加(OR=1.20， 95%CI=1.01～1.43，P=0.04)。單因素分析時(shí)GG基因型者CHD危險(xiǎn)顯著增加(OR=1.83，95%CI=1.05～3.20，P=0.04)。在調(diào)整年齡、性別、吸煙、飲酒、體重指數(shù)、血甘油三酯、高血壓史、糖尿病史及CHD家族史等變量后，GG基因型與CHD危險(xiǎn)增加比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=1.63，95%CI=0.89～3.00，P=0.12)，各值見(jiàn)表3。

表3 BNP rs198389基因多態(tài)性與CHD的相關(guān)性

2.4 多元逐步Logistic回歸模型分析結(jié)果CHD主要影響因素依次為高血壓史、糖尿病史、吸煙、CHD家族史、飲酒和性別，其中高血壓史、糖尿病史、吸煙、CHD家族史和性別(男性)使CHD危險(xiǎn)顯著增加，而飲酒使其下降?；蛐蜎](méi)有被納入回歸模型最后步驟，提示BNP基因rs198389基因型可能不是CHD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見(jiàn)表4。

表4 CHD主要影響因素Logistic回歸模型

3 討論

腦鈉尿肽即B型利鈉肽屬于多肽類(lèi)激素家族，可能通過(guò)抑制內(nèi)皮細(xì)胞功能、抗纖維化、抑制心肌細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞的增殖、介導(dǎo)脂解作用等參與CHD的發(fā)生、發(fā)展，其臨床應(yīng)用價(jià)值越來(lái)越受到重視。

CHD是一種環(huán)境和遺傳因素共同作用而導(dǎo)致的常見(jiàn)疾病，近年來(lái)關(guān)于CHD遺傳易感性相關(guān)基因的研究成為熱點(diǎn)。人的BNP與ANP基因呈串聯(lián)排列，位于1號(hào)染色體上(1p36.2)，含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，編碼BNP激素原前體[2]。不同于ANP的分泌主要受激素分泌水平調(diào)控，BNP直接受到基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控[3]。因而，BNP基因多態(tài)性可能影響B(tài)NP基因表達(dá)活性或蛋白質(zhì)功能。BNP基因rs198389位點(diǎn)位于基因5'端啟動(dòng)子區(qū)，其SNP可能對(duì)基因啟動(dòng)子活性產(chǎn)生直接影響，從而影響B(tài)NP基因表達(dá)，進(jìn)一步作用于CHD的疾病過(guò)程。在蛋白質(zhì)水平上，關(guān)于BNP與CHD的研究很多。PREVEND研究顯示，NT-proBNP水平與心血管事件發(fā)生率顯著相關(guān)，NT-proBNP水平每升高一倍使全因死亡率增加22%和心血管事件風(fēng)險(xiǎn)增加16%，認(rèn)為NT-proBNP是死亡風(fēng)險(xiǎn)和心血管事件風(fēng)險(xiǎn)強(qiáng)有力的預(yù)測(cè)因子[4]。檢測(cè)BNP水平可用急性冠脈綜合征危險(xiǎn)分層[5]。在基因水平上，BNP與CHD的研究國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少，近期有幾個(gè)關(guān)于BNP基因rs198389與疾病相關(guān)性的研究。冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)基因組試驗(yàn)(The CABG Genomics Study)對(duì)7個(gè)相關(guān)基因139個(gè)SNPs進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，NPPA/NPPB基因7個(gè)位點(diǎn)SNPs與CABG術(shù)后心衰風(fēng)險(xiǎn)降低有關(guān)，其中包括rs198389位點(diǎn)，其次要等位基因與CABG術(shù)后心衰發(fā)生率降低顯著相關(guān)[6]。并且認(rèn)為等位基因編碼的BNP質(zhì)和量發(fā)生變化后，通過(guò)自分泌和旁分泌作用于心室肌，減輕術(shù)后心衰的發(fā)生[7]。Ellis等[8]發(fā)現(xiàn)NPPB基因位點(diǎn)rs198389的次要等位基因顯著升高血BNP和NT-proBNP水平，使舒張?jiān)缙诙獍暄魉俣扰c二尖瓣環(huán)運(yùn)動(dòng)速度比值、左心室收縮末期容積指數(shù)和左心室舒張末期容積指數(shù)顯著減少，降低以心血管事件原因的再次住院率，認(rèn)為BNP基因?qū)π难苡斜Ｗo(hù)作用。但也有臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)基因多態(tài)性與疾病臨床情況無(wú)關(guān)聯(lián)，Costello-Boerrigter等[9]發(fā)現(xiàn)BNP基因rs198389多態(tài)性與心血管表型或生存率無(wú)顯著相關(guān)。研究結(jié)果的不同可能與試驗(yàn)對(duì)象、方法和樣本量不同有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)BNP基因上5'端啟動(dòng)子區(qū)rs198389位點(diǎn)多態(tài)性與CHD危險(xiǎn)性相關(guān)。等位基因G顯著增加CHD危險(xiǎn)，GG基因型在單因素分析時(shí)使CHD危險(xiǎn)性顯著增加，提示該位點(diǎn)多態(tài)性可能成為CHD的一種遺傳易感性標(biāo)志物。本研究還顯示在調(diào)整性別、年齡、吸煙、飲酒、體重指數(shù)、血甘油三脂、高血壓和糖尿病史、CHD家族史等混雜因素后，GG基因型與CHD危險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與CHD的遺傳機(jī)制呈多種微效基因積累作用模式有關(guān)，也可能是BNP基因rs198389位點(diǎn)在人群中突變率低(GG基因型為3.6%)影響了統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CHD病因?qū)W的復(fù)雜性決定了可能并不存在明顯的主效基因，因而單個(gè)微效基因多態(tài)性可能與CHD關(guān)聯(lián)不顯著。研究顯示不同基因多態(tài)性有協(xié)同作用[10]，因此，CHD的遺傳易感性研究需選擇多個(gè)候選基因，同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因多態(tài)性，綜合分析整體影響。

總之，鈉尿肽基因多態(tài)性分析進(jìn)一步提高了對(duì)疾病分子學(xué)機(jī)制的理解，對(duì)研究CHD風(fēng)險(xiǎn)人群的篩查、個(gè)體化預(yù)防、診斷和治療具有重要的意義，但尚需符合遺傳學(xué)研究統(tǒng)計(jì)要求的大樣本及多基因多態(tài)性聯(lián)合研究及重復(fù)驗(yàn)證。

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Association between single nucleotide polymorphism rs198389 in brain natriuretic peptide gene and coronary heart disease.

LEI Ru,JIANG Xiao-qing,WANG Li-ping,XIAO Wei,LIU Huang-jun.Department of Cardiology,the First People's Hospital of Jingzhou,Jingzhou 434000,Hubei,CHINA

ObjectiveTo investigate the association between single nucleotide polymorphism rs198389 in-brain natriuretic peptide(BNP)gene and coronary heart disease(CHD).MethodsPatients with CHD(the CHD group,n=961)and 961 healthy subjects(n=961,the control group)were enrolled in this study.The BNP rs198389 polymorphism was genotyped by real-time quantitative polymerase chain reaction(Real-time qPCR).The association between BNP rs198389 polymorphism and CHD was analyzed by SPSS10.0 software.ResultsThere was statistically significant difference in the distribution ofAAand GG genotypes between the CHD group and the control group(P＜0.05).The frequencies of GG genotype and G allele were significantly higher in CHD group(3.6%and 16.7%)than in the control group(2.1%and 14.3%).G allele carries significantly higher risk of CHD thanA allele(P=0.04).GG genotype presented a significantly higher risk of CHD(P=0.04),but this risk was not more significant when adjusted for CHD risk factors by unconditional Logistic regression analysis(P=0.12).ConclusionThe G allele of BNP gene rs198389 site significantly increased the risk of CHD.The results suggest that BNP gene rs198389 may be a susceptibility gene of CHD,but it is not independent risk factor.

Brain natriuretic peptide;Single nucleotide polymorphism;Coronary heart disease

R541.4

A

1003—6350（2013）09—1258—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.09.0532

2012-12-13)

肖衛(wèi)。E-mail：99xw@sina.com