基于生物工程的廢次煙葉資源化技術(shù)研究

周國生，義勝輝，崔建軍，楊秋林，劉勇軍，趙松義，鄭青葉，李利龍，向 洋*

（1.湖南煙葉復(fù)烤有限公司，湖南 郴州 432000；2.湖南省煙草公司，長沙 410004；3.長沙理工大學(xué)環(huán)境工程及生物技術(shù)研究所，長沙 410114）

我國每年煙葉產(chǎn)量 200多萬t，但對煙葉的利用方式比較單一，至今仍沿襲傳統(tǒng)的生產(chǎn)模式，專用于制作卷煙，沒有充分發(fā)揮其多種功效的生物學(xué)特性，把吸用、飼用、藥用以及食用產(chǎn)品的開發(fā)結(jié)合起來，綜合加以利用[1-2]。

煙草中含有的煙堿等次生代謝物，不僅是保健品、戒煙膏、治療關(guān)節(jié)痛和肌肉痙攣的外用藥等產(chǎn)品的原料，而且還可用于生產(chǎn)高效低殘留的有機(jī)農(nóng)藥，廣泛應(yīng)用于水果和蔬菜等作物作為殺蟲劑[3]。廢棄的煙草殘?jiān)泻喾N氨基酸和微量元素，營養(yǎng)成分高，還可用于生產(chǎn)飼料和有機(jī)生物肥料等。將煙草飼料作為一種新型節(jié)糧飼料，開辟新的飼料資源，緩解人畜爭糧矛盾，不失為一種新的選擇[4]。

近年來，隨著煙葉種植面積、煙葉產(chǎn)量、卷煙產(chǎn)量的逐年增加，卷煙市場對名特優(yōu)煙葉需求的提高，煙葉廢棄資源的總量亦在逐年增加[5]。因此，對廢棄煙葉的綜合利用提出了更高的要求，不僅僅牽涉到生態(tài)環(huán)境惡化的問題，而且還是資源合理利用的迫切需求。本研究探索廢次煙葉綜合利用技術(shù)，為提高廢次煙葉的利用率提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

廢次煙葉中煙梗和煙末由湖南煙葉復(fù)烤有限公司提供、煙葉由湖南省煙草公司郴州市公司提供；芝麻餅、豆餅、菜籽餅由當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶提供；菌種由長沙理工大學(xué)向洋教授實(shí)驗(yàn)室分離；鳳尾菇由湖南省食用菌研究所提供。五月慢種子由南京金盛達(dá)種子有限公司提供；空心菜種子由廣西柳州市興旺蔬菜良種經(jīng)營部提供。藥品包括95%乙醇、氫氧化鈉、石油醚、無水乙醚、正乙烷、95%～98%硫酸，均為分析純。培養(yǎng)基為馬鈴薯培養(yǎng)基[6]。

1.2 廢棄煙葉中煙堿的提取及純化

1.2.1 煙葉的預(yù)處理 將廢棄煙葉置于恒溫箱中，在100 ℃下干燥1 h，取出在研缽中粉碎，再置于玻璃干燥器中待用。

1.2.2 浸提液的制備 取上述粉碎的煙葉10 g，放在燒杯中用適量的蒸餾水浸泡，并把燒杯放在80℃的水浴鍋中，每隔一段時(shí)間擠壓過濾、換水，繼續(xù)浸泡。一直到浸泡液呈現(xiàn)淡淡的黃色，煙葉中的煙堿基本上被提取出來，濾渣用蒸餾水多次清洗，并將多次清洗液和浸泡液合并移至250 mL容量瓶中，定容至刻度線。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得方程為y=0.1764+2.2918x，r=0.999**，式中y為吸光度，x為煙堿濃度（mg/mL)[7]。

1.2.4 萃取 分別用正己烷、石油醚和二氯甲烷萃取，得出最佳萃取劑。每種試劑萃取3次，所用萃取劑與萃取液比值分別為 1∶1、1.5∶1、1.5∶1、2.5∶1、3∶1。通過比較分光光度值，根據(jù)1.2.3的標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定萃取劑與萃取液的最佳比值。

1.2.5 蒸餾 恒溫水浴加熱萃取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行蒸餾，待再次重復(fù)使用，剩余物質(zhì)即是粗煙堿。

1.3 煙堿抑菌殺蟲劑的制備及試驗(yàn)

1.3.1 煙草浸出液的制取 將預(yù)處理后的廢棄煙葉5 g置于干燥的燒杯中，并定容至刻度線，得到煙草浸出液。

1.3.2 煙堿稀釋液的制備 分別取煙草浸出液與蒸餾水混合，得到5個(gè)不同濃度的煙堿稀釋液。

1.3.3 煙堿對微生物的生長抑制試驗(yàn) 將 1.3.2所得煙堿稀釋液各取1 mL分別置于5號培養(yǎng)皿中，用1 mL無菌水作對照。將此6個(gè)培養(yǎng)皿用馬鈴薯培養(yǎng)基倒平板，混合均勻，冷卻后接入菌懸液 0.1 mL，各做一組平行試驗(yàn)，倒置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，觀察抑菌作用。

1.3.4 煙堿對蚜蟲的驅(qū)殺作用試驗(yàn) 將50 mL煙草浸出液裝入小型噴霧器中，噴灑約5 mL于長滿蚜蟲的空心菜葉面，觀察1 d驅(qū)殺效果。

1.4 利用廢次煙草作為食用菌栽培原料試驗(yàn)

試驗(yàn)流程：廢次煙草→脫毒→滅菌→接種→培養(yǎng)→觀察。

1.4.1 廢次煙葉預(yù)處理 將廢棄煙葉置于恒溫干燥箱中，于100 ℃條件下烘干30 min，取出粉碎至2mm左右，置干燥處進(jìn)行脫毒處理。

1.4.2 滅菌 將脫毒處理的廢次煙葉置于121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.4.3 調(diào)節(jié)濕度 待冷卻后，在超凈臺(tái)下調(diào)節(jié)煙葉殘?jiān)臐穸仍?60%～65%[8-9]。

1.4.4 接種培養(yǎng) 將食用菌菌種接入培養(yǎng)皿中，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱下培養(yǎng)。

1.5 煙梗煙末殘?jiān)鳛樯镉袡C(jī)肥試驗(yàn)

廢次煙草→脫毒→接種→培養(yǎng)→檢測游離氨基酸。

1.5.1 菌種的擴(kuò)大培養(yǎng) 以芝麻籽:菜籽餅:豆餅，按 6:3:1比例混合均勻，加入適量的水，包扎并滅菌。將CL01-1和CL02-1菌分別接入冷卻后的混合料中，培養(yǎng)至混合料基本成為粉狀，待用。

1.5.2 廢次煙葉預(yù)處理 將廢棄煙葉置于恒溫干燥箱中，于100 ℃條件下烘干30 min，取出粉碎至2mm左右，并將上述錐形瓶于121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.5.3 調(diào)節(jié)濕度 待冷卻后，在超凈臺(tái)下調(diào)節(jié)煙葉殘?jiān)臐穸仍?0%～65%。

1.5.4 接種培養(yǎng) 分別接入CL01-1和CL02-1菌，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱下培養(yǎng)。

1.5.5 檢測氨基酸 用高效液相色譜法檢測接種培養(yǎng)處理后的廢次煙草葉中游離氨基酸量。

1.5.6 肥效試驗(yàn) 將上述培養(yǎng)5 d后的廢次煙葉在100 ℃進(jìn)行干燥，殺死菌種并將冷卻后的培養(yǎng)料加入空心菜水培液，并將一部分施入五月慢試驗(yàn)地，觀察空心菜和五月慢的生長情況。

2 結(jié) 果

2.1 廢棄煙葉中煙堿提取及純化結(jié)果

煙堿提取和純化試驗(yàn)主要結(jié)果見圖1～3。從圖1可以看出，隨著pH的增大，煙堿提取濃度提高。pH值為12時(shí)達(dá)到最大值，此pH時(shí)煙堿提取效果為最好，達(dá)0.1857 mg/mL。

3種萃取劑正己烷萃取效果最好，煙堿提取量達(dá) 0.1900 mg/mL（圖2）。利用正己烷萃取時(shí)，分層較快且很明顯，易于將水相與有機(jī)相分離，不易出現(xiàn)乳化現(xiàn)象。因此，選擇正己烷正作為萃取溶劑最為合適。

隨著萃取劑用量的增加，煙堿提取率呈上升趨勢，當(dāng)萃取劑∶萃取液為 3∶1時(shí)最高，煙堿為0.1489 mg/mL（圖3）。

圖1 煙堿溶液中煙堿濃度與pH的關(guān)系Fig.1 The relationship between nicotinic concentration and pH value in nicotinic solution

圖2 不同萃取劑提取效果Fig.2 The effect of extraction agent on nicotinic concentration

圖3 不同萃取劑與萃取液比值的提取效果Fig.3 The ratio of extraction agent and the extraction liquid

2.2 煙堿抑菌殺蟲效果

與空白對照相比，煙堿對培養(yǎng)皿中微生物的生長繁殖抑制作用非常明顯，且煙堿濃度越高，抑制越強(qiáng)（圖4）。

圖4 不同比例煙堿溶液抑菌效果Fig.4 The inhibition effect of nicotine on the growth of microorganism

圖5顯示了煙堿對植物蚜蟲的驅(qū)殺效果，可以看出，在噴灑煙草浸出液之前（圖5a），空心菜葉面的蚜蟲生命活動(dòng)旺盛；噴灑后（圖5b），蚜蟲的生命活動(dòng)由于受到煙堿的抑制而減慢，生命力減弱，掉落于桌面以致死亡；噴灑煙草浸出液之后置于培養(yǎng)皿中的葉面蚜蟲（圖5c），也同樣出現(xiàn)了死亡的現(xiàn)象。因此，利用煙草浸出液中含有的煙堿在處理蚜蟲病害的時(shí)候，由于煙堿對蚜蟲（蟲害）的生命活動(dòng)的抑制，使得蚜蟲（蟲害）最終減少和死亡，從而對病蟲有著明顯的驅(qū)殺作用。

圖5 煙堿處理蚜蟲前后對照圖Fig.5 The effect of nicotine on aphids

2.3 食用菌菌絲生長結(jié)果

廢次煙葉經(jīng)處理后，培養(yǎng)食用菌6 d觀察所得結(jié)果見表1。

表1 各溶液處理后培養(yǎng)6 d的菌絲長勢Table 1 The mycelial growth with various treatment

2.4 肥效試驗(yàn)結(jié)果

在空心菜水培液中加入2種菌處理的煙葉有機(jī)肥后，實(shí)驗(yàn)組比對照組空心菜顏色深，株高高1倍多，生長更旺盛（圖6a）。施用發(fā)酵處理后的煙葉生物質(zhì)肥的五月慢生長狀況比對照生長狀況旺盛（圖6b）。

發(fā)酵前后廢次煙葉游離氨基酸含量見表2?？梢钥闯觯珻L01-1和CL02-1菌都能將蛋白質(zhì)不同程度的分解為游離氨基酸，且分解之后得到的游離氨基酸富有營養(yǎng)，能較好地促進(jìn)植物的生長。

廢次煙葉生物質(zhì)肥的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CL01-1處理之后，游離甘氨酸增加最多為原來游離甘基酸的73.8倍，游離精氨酸增加的量最少；CL02-1處理之后，游離亮氨酸增加的最多，為原來游離亮氨酸的83.9倍。

圖6 生物有機(jī)肥施用效果Fig.6 The effect of bio-organic fertilizer application

表2 菌種處理后氨基酸含量（g/100g樣品）變化Table 2 The amino acid content change due to culture process

3 小 結(jié)

（1）廢次煙葉經(jīng)生物工程技術(shù)處理后，能作為良好的工業(yè)原料，并可直接加工為具有抑制微生物生長繁殖和驅(qū)殺蟲害作用的生物農(nóng)藥。

（2）經(jīng)脫毒處理后的煙葉殘?jiān)?，含多種氨基酸，營養(yǎng)成分豐富，因此，可作為培養(yǎng)食用菌和生產(chǎn)生物有機(jī)肥的良好原料。

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