熱帶淡水產(chǎn)油微藻的分離篩選與鑒定

郝宗娣 劉平懷 楊 勛 張 森

(海南大學(xué)熱帶作物種質(zhì)資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 海口570228)

化石燃料極大地促進(jìn)了近代工業(yè)的發(fā)展, 其影響一直延續(xù)至今。然而, 化石燃料儲(chǔ)量有限, 并且已引發(fā)生態(tài)環(huán)境的破壞, 嚴(yán)重威脅人類的生存[1]。因此尋找可持續(xù)發(fā)展的環(huán)境友好型能源是當(dāng)今社會(huì)亟待解決的問(wèn)題。生物質(zhì)能源具有環(huán)保和可再生性, 發(fā)展生物質(zhì)能源被認(rèn)為是全球能源危機(jī)的最理想途徑之一。生物柴油在能量密度、燃燒性能等方面同石化柴油相似性極高, 是石化柴油的最佳替代品。微藻是一類光合自養(yǎng)的低等植物, 是自然界中起源最早、分布最廣、種類和數(shù)量龐大的生物種質(zhì)資源庫(kù)。在適當(dāng)條件下, 很多微藻可積累大量的油脂, 其單位面積油產(chǎn)量可高達(dá)油料植物產(chǎn)量的數(shù)十倍[2]。另外微藻的生長(zhǎng)周期短, 可使用工業(yè)廢水培養(yǎng), 固定大量的 CO2, 這些優(yōu)點(diǎn)無(wú)疑可用于解決當(dāng)下溫室效應(yīng)加劇、空氣及水體污染和石化能源危機(jī)等重大問(wèn)題[3]。

獲得性能優(yōu)越的產(chǎn)油能源微藻是從事基礎(chǔ)研究和規(guī)模化生產(chǎn)的關(guān)鍵, 其中微藻培養(yǎng)過(guò)程中生物量的積累量和油脂含量是體現(xiàn)產(chǎn)油能源微藻應(yīng)用價(jià)值的兩個(gè)重要指標(biāo)。一直以來(lái), 富油藻種篩選方面的諸多研究仍然集中于一些藻種庫(kù)或?qū)嶒?yàn)室保藏的現(xiàn)有藻種, 限制了在藻種資源方面的拓展。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外開(kāi)始注重自然界中優(yōu)勢(shì)顯著藻種的篩選, 如Thi,et al.[4]自泰國(guó)海域分離得到的一株微擬球藻(Nannochloropsissp.)油脂含量高達(dá)(44.8±1.7)%,Reda,et al.[5]自淡水河水體中分離出的一株斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)的油脂含量高達(dá)(58±1.5)%。據(jù)估計(jì),自然界中存在約 40000種微藻, 但被人類開(kāi)發(fā)利用的數(shù)量不多[6]。因此, 繼續(xù)開(kāi)發(fā)自然界的微藻資源, 從中篩選高產(chǎn)油微藻并利用其生產(chǎn)生物柴油, 可起到充分利用資源的作用, 具有良好的應(yīng)用前景。

本研究自海南熱帶自然水體中分離出藻株, 利用一套高效的微藻篩選及產(chǎn)油性能評(píng)價(jià)的方法對(duì)其進(jìn)行篩選,目的是獲得生長(zhǎng)速度快、油脂產(chǎn)量高的藻株, 以期為微藻生物柴油的研究開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藻種的分離純化

野外水樣采自海口市河流、水庫(kù)、小池塘等水體, 浮游微藻采用浮游生物網(wǎng)拖采, 底棲微藻采用刀片輕輕刮取水體中的石塊、樹(shù)枝、腐葉等物體表面。采集到的水樣用裝有已滅菌培養(yǎng)基的透明塑料瓶保存, 帶回實(shí)驗(yàn)室待處理。

水樣中微藻的分離純化使用平板涂布法[7]： 配制BG11液體培養(yǎng)基, 加入 15—20 g/L的瓊脂粉加熱融化,制作平板。吸取少量的水樣接種于固體平板上, 置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2—3周待藻落長(zhǎng)出后, 用接種環(huán)挑出單藻落接種于24孔板中進(jìn)行純化培養(yǎng)10d后鏡檢, 將純種藻株轉(zhuǎn)入試管中培養(yǎng)并保種[8]。

1.2 富油微藻的篩選

初篩使用尼羅紅染色法進(jìn)行： 取純化后的藻液100 μL置于96孔板中, 加入50 μL的尼羅紅染液(尼羅紅-DMSO,10 μg/mL), 漩渦震蕩混合后于黑暗中孵育 10min, 利用熒光倒置顯微鏡進(jìn)行觀察[3]。選出黃色熒光較強(qiáng)的藻株,以進(jìn)行復(fù)篩。復(fù)篩時(shí)微藻的生長(zhǎng)、產(chǎn)油性能的評(píng)價(jià)試驗(yàn)采用φ8 cm的玻璃柱狀光生物反應(yīng)器培養(yǎng), 培養(yǎng)基選用BG11。接種密度在A6800.08, 單側(cè)日光燈24h連續(xù)光照, 光強(qiáng)約為40 μmol/(m2·s), 通入無(wú)菌壓縮空氣, 培養(yǎng)溫度為(28±2)℃。

1.3 生長(zhǎng)參數(shù)測(cè)定

在培養(yǎng)期間, 每天取樣在顯微鏡下觀察其變化, 以保證藻液的純度; 隔日采用 TU-1810紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定藻液的A680; 培養(yǎng)結(jié)束時(shí), 取20 mL藻液, 使用已烘干稱重的濾膜抽濾, 80℃烘干后測(cè)定總重, 計(jì)算生物量。干重測(cè)定重復(fù)三次, 取平均值。

1.4 粗脂含量測(cè)定

培養(yǎng)結(jié)束后, 收集藻液離心(8000 r/min, 15min), 藻泥收集于保鮮盒中真空冷凍干燥后稍加研磨獲得藻粉。粗脂提取步驟參照許瑾等[8]等的方法。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次, 取平均值。

1.5 富油微藻的脂肪酸成分分析

皂化： 取50 mg粗脂置于螺口玻璃瓶中, 加入5 mL的2%硫酸甲醇溶液, 充入氮?dú)夂蠓忾], 100℃烘箱中加熱1h, 冷卻至室溫。甲酯化： 加入5 mL 5%的三氟化硼甲醇溶液, 80℃加熱30min冷卻至室溫后加入3 mL蒸餾水和2 mL正己烷, 漩渦震蕩后靜置分層, 取上層置于2 mL的微量離心管中, 封口待測(cè)。

GC-MS色譜條件[9]： 石英毛細(xì)管柱 HP-FFAP (30 m×0.25 mm, 0.25 m), 程序升溫： 從160℃開(kāi)始, 以6℃/min升到250℃, 保持5min; 載氣為 He, 柱流量1.0 mL/min,進(jìn)樣口溫度 250℃, 分流比 50∶1。質(zhì)譜條件： EI 源; 電離電壓70 eV, 離子源溫度230℃, 掃描范圍10—500 amu,進(jìn)樣量 1.0 μL。

1.6 富油微藻的分子鑒定

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻液離心后棄去上清, 藻泥置于微量離心管中, 使用PlantGen DNA Kit (北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)按照說(shuō)明書提取并純化藻株基因組DNA。

PCR擴(kuò)增： 藻株1C4參考文獻(xiàn)[5]的方法擴(kuò)增LSU序列, 引物序列為： Forward 5′-AGCGGAGGAAAAGAAAC TA-3′; Reverse 5′-TACTAGAAGGTTCGATTAGTC-3′; 藻株11B7參考文獻(xiàn)[10]的方法擴(kuò)增其ITS1、5.8S rDNA及ITS2 全序列, 引物序列為： Forward 5′-GAAGTCGTAACAA GGTTTCC-3′; Reverse 5′-TCCTGGTTAGTTTCTTTTCC-3′。PCR 反應(yīng)體積為 25 μL, 包括 DNA 模板 1 μL, TaKaRaTaq酶 0.2 μL (1U), 引物(濃度為 10 μmol/L)各 1 μL、dNTP(濃度為 2.5 mmol/L)2 μL、10×buffer (Mg2+Plus)2.5 μL,ddH2O 17.3 μL。擴(kuò)增反應(yīng)在Takara-TP600型PCR儀上進(jìn)行, PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 進(jìn)一步純化后送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序, 所獲得的基因序列在 NCBI 服務(wù)器上 (http：//www.ncbi.nih.gov) 用BLAST 進(jìn)行同源檢測(cè)。

進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建： 根據(jù)同源檢測(cè)結(jié)果, 從NCBI上下載相關(guān)的序列, 應(yīng)用 ClustalX1.83 軟件進(jìn)行多序列比對(duì);通過(guò)MEGA5以鄰接法(Neighbor-Joining Method, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 水樣采集及微藻分離

于?？谥苓叢杉畼蛹s60份, 經(jīng)涂布分離法初步得到藻種 300株, 通過(guò)細(xì)胞形態(tài)及尼羅紅染色的情況從中初步篩選出15株具有產(chǎn)油潛力的藻株, 進(jìn)行復(fù)篩。

2.2 藻株的復(fù)篩及產(chǎn)油潛力評(píng)價(jià)

對(duì)通過(guò)初篩后的藻株進(jìn)行復(fù)篩(表 1), 可見(jiàn), 有些微藻的油脂含量較高, 但生物量不高, 如 10C7, 油脂含量高達(dá)45.09%, 但生物量?jī)H有0.67 g/L; 反之, 一些生物量較高的藻含油量卻比較低, 如10F6, 生物量高達(dá)1.58 g/L,但油脂含量?jī)H為 18.02%。因此, 應(yīng)該綜合生物量和油脂含量來(lái)考察藻株產(chǎn)油性能, 該指標(biāo)稱為總脂收獲量, 即微藻總脂含量與生物量的乘積, 表示實(shí)際收獲的油脂量。復(fù)篩過(guò)程中總脂收獲量超過(guò)0.45 g/L的藻株有1C4、2H4、1H8、11B7, 它們分別高達(dá)0.66、0.49、0.45和0.59 g/L。

2.3 富油微藻的脂肪酸成分分析

1C4、2H4、1H8、11B7四種富油微藻的脂肪酸成分及其相對(duì)含量(表2)。

目前的高速柴油機(jī)燃料的十六烷值約為 40—56,大多數(shù)的柴油機(jī)可采用的十六烷值 40—45。棕櫚酸(C16：0)甲酯、棕櫚油酸(C16：1)甲酯、硬脂酸(C18：0)甲酯和油酸(C18：1)甲酯的十六烷值分別為 85.9、51.0—59.59、101和56.55—59.3[11], 均高于國(guó)內(nèi)及國(guó)際上主要國(guó)家現(xiàn)行的生物柴油標(biāo)準(zhǔn)十六烷值(>45—51)[12]。由表3可知, 4種富油微藻中以上4種脂肪酸含量達(dá)到了43.52%—77.56%, 其中以1H8最高。在4株富油微藻中, 總脂收獲量最大的 1C4, 但其脂肪酸的總體不飽和程度較高(二烯酸和三烯酸的含量超過(guò)了總脂的46%)。適量的不飽和脂肪酸會(huì)增加生物柴油低溫下的流動(dòng)性, 但過(guò)量又會(huì)降低生物柴油的穩(wěn)定性[13], 因此選擇該藻作為生物柴油來(lái)源時(shí), 需加入抗氧化劑以提升其抗氧化性能。另外11B7和1H8的總脂收獲量雖次于1C4, 但二者脂肪酸不飽和程度低(C18：1的含量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于1C4), 因此抗氧化性能更好。值得注意的是, 2H4中還含有一定量的 EPA(二十碳五烯酸), 在生產(chǎn)生物柴油的同時(shí)還可開(kāi)發(fā)高價(jià)值副產(chǎn)物。

表1 15株微藻的收獲時(shí)干重與總脂收獲量比較Tab.1 Biomass concentration, lipid content and lipid yield of 15 microalgal strains

表2 四種富油微藻的脂肪酸成分Tab.2 Fatty acid composition of several microalgal strains

2.4 兩株富油微藻的鑒定

富油微藻1C4和11B7的基因組DNA經(jīng)提取純化后,PCR分別得到 1C4的 LSU片段和 11B7的 ITS1、5.8S rDNA、ITS2的部分片段, 其大小分別約為 850和 1500 bp。經(jīng)BLAST分析結(jié)果表明, 1C4的LSU片段DNA序列分別同 EU410621.1Chlamydomonas reinhardtii、DQ373067.1C.incerta的部分片段相似度高達(dá) 98%和99%, 11B7的ITS1、5.8S rDNA及ITS2序列片段同GQ 375101.1Hariotina reticulata、JN703736.1pectinatus的部分片段相似度高達(dá)97%和91%。綜合序列比對(duì)、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖1、圖2)、二者顯微形態(tài)(圖3)等結(jié)果, 初步確定1C4和11B7分別屬于衣藻屬和空星藻屬。

3 討論

3.1 富油微藻的篩選

在自然界中存在大量性能優(yōu)越的微藻可作為生物柴油、餌料或高價(jià)值活性成分的來(lái)源。如雨生紅球藻可積累較高含量的蝦青素, 硅藻中富含多不飽和脂肪酸, 螺旋藻中富含藻膽蛋白[14]等。在能源危機(jī)的推動(dòng)下, 目前各國(guó)大力發(fā)展的生物柴油已成為國(guó)際上發(fā)展最快、應(yīng)用最廣的環(huán)保型可再生能源。微藻作為生物柴油的一種理想來(lái)源,重點(diǎn)是選擇一種合適的藻種作為生物柴油原材料[15]。本試驗(yàn)最終篩選出4株富油微藻, 總脂收獲量均在0.45 g/L以上, 具有較高的產(chǎn)油潛力。

圖1 藻株1C4系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of strain 1C4

目前, 微藻油脂的生產(chǎn)中存在較多限制, 這就導(dǎo)致了目前微藻生物柴油成本偏高。如何降低生產(chǎn)成本, 實(shí)現(xiàn)其商業(yè)化運(yùn)作是解決微藻生物柴油產(chǎn)業(yè)化的重要問(wèn)題。提高藻種油脂收獲量或生產(chǎn)高價(jià)值副產(chǎn)物是降低微藻生物柴油成本較為理想的途徑。本文自熱帶淡水水體中分離出約 300株微藻并通過(guò)尼羅紅染色法初篩, 再以初篩所得15株具有產(chǎn)油潛力的藻株作為研究對(duì)象, 設(shè)置相同的培養(yǎng)條件, 比較它們的生長(zhǎng)狀況及最終油脂收獲量, 篩選具有高效產(chǎn)油潛力的藻株。最終得到4株生長(zhǎng)狀況較好并且含油量在25%以上的藻種, 通過(guò)對(duì)其中1C4和11B7兩株油脂收獲量高于0.5 g/L的藻種進(jìn)行分子鑒定, 初步確定二者分別屬衣藻屬和空星藻屬。在培養(yǎng)過(guò)程中, 筆者還觀察到11B7培養(yǎng)后期易沉降, 可充分利用這一點(diǎn)對(duì)其進(jìn)行采收, 大大減少設(shè)備投入和能源消耗, 從而進(jìn)一步降低微藻生物柴油的生產(chǎn)成本。

3.2 微藻的鑒定

傳統(tǒng)的微藻鑒定方法主要依賴于光學(xué)顯微鏡, 即在顯微鏡下對(duì)微藻形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察和一些藻體所固有的生理生化特性。但是由于微藻細(xì)胞微小, 加之近緣種之間的形態(tài)差異非常不明顯, 即使在顯微鏡下也很難確定其準(zhǔn)確的分類地位[16]。近年來(lái)興起的分子生物學(xué)方法通過(guò)選擇有代表性的序列片段作為分類標(biāo)準(zhǔn)來(lái)區(qū)分不同生物、同種生物種內(nèi)株系之間的遺傳差異, 具有操作容易、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn), 被廣泛用于赤潮藻類及其他微藻的鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化研究中[17]。核糖體RNA(rRNA)基因片段是在微生物的分子鑒定中常用的序列[18,19], 其中小亞基 rRNA(Small subunit rRNA, SSU rRNA)基因序列比大亞基rRNA(Large subunit, LSU rRNA)基因序列更為保守, 因此更適于分析親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的藻株, 相應(yīng)地, LSU rRNA基因序列就更適用于分析親緣關(guān)系較近的藻株, 如同屬的不同株系。此外還有線粒體DNA(mitochondria DNA)序列、質(zhì)體DNA(plastid DNA, rbcL)序列、ITS(Internal Transcribed Sequences)序列及微衛(wèi)星DNA(microsatellite DNA)序列等也可用于分子鑒定。本實(shí)驗(yàn)分別擴(kuò)增出1C4的LSU序列及11B7的ITS1、5.8S rDNA及ITS2序列并在NCBI服務(wù)器上進(jìn)行BLAST比對(duì)分析, 同時(shí)結(jié)合二者細(xì)胞形態(tài)對(duì)其進(jìn)行鑒定, 具有較高的準(zhǔn)確度和可信度。

4 結(jié)論

在自然界中微藻種質(zhì)資源豐富, 其中以綠藻最易分離獲得, 并能夠快速生長(zhǎng)。油脂含量測(cè)定及脂肪酸GC-MS分析結(jié)果顯示本研究中所分離的富油綠藻中脂肪酸成分也富含適宜作為生物柴油來(lái)源的脂肪酸?；蚱涡蛄蠦LAST分析、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建并結(jié)合細(xì)胞形態(tài)分析兩株高產(chǎn)油微藻, 初步確定二者分別屬衣藻屬和空星藻屬。其中11B7培養(yǎng)后期易沉降, 因此可實(shí)現(xiàn)低成本采收。對(duì)于二者產(chǎn)油生理與生化機(jī)制、生長(zhǎng)及產(chǎn)油條件的優(yōu)化有待進(jìn)一步研究, 以期微藻生物柴油產(chǎn)業(yè)化奠定良好的基礎(chǔ)。

圖2 藻株11B7系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of strain 11B7

圖3 1C4(A) 和11B7的顯微照片(400×)Fig.3 Microscopic photo of 1C4 (A) and 11B7(B)

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