超聲波輔助提取法測(cè)定茶葉中咖啡因

劉華戎，董文明

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)校團(tuán)委，云南昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201）

茶葉中含有多種生物堿，其咖啡因的含量占茶葉干物質(zhì)總量的2.0%～5.0%，咖啡因亦稱(chēng)咖啡堿，化學(xué)名稱(chēng)為1，3，7-三甲基-2，6-二氧嘌呤，化學(xué)式C8H10N402，相對(duì)分子質(zhì)量為194.19，易溶于水。溶點(diǎn)為235 ℃～237 ℃，弱堿性，白色結(jié)晶粉末，無(wú)臭，味苦，有風(fēng)化性[1]。能溶于水、醇、氯仿、二氯甲烷等溶劑?？Х纫蚴且环N重要的醫(yī)藥工業(yè)原料，具有增加腎臟血流量、強(qiáng)心、利尿、興奮神經(jīng)中樞、消除疲勞等作用，因此，研究茶葉中咖啡因的含量，有助于我們適量飲用，正確、合理利用茶葉的各種保健功能[2]。與常規(guī)提取技術(shù)相比，超聲波輔助提取具有快速、價(jià)廉、提取率高等優(yōu)點(diǎn)[3]。針對(duì)超聲波特有的能量，作為茶葉樣品咖啡因提取前處理技術(shù)，采用三氯甲烷作為提取溶劑，離心萃取咖啡因，依據(jù)咖啡因在275.0 nm 處有最大吸收，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定茶葉及茶葉制品中咖啡因含量，旨在建立一種測(cè)定茶葉及茶葉制品咖啡因含量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

茶葉：2011 年昆明市市場(chǎng)隨機(jī)購(gòu)買(mǎi)，所有茶葉樣品均置于60 ℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干至恒重，粉碎，干燥器內(nèi)保存、備用。

1.2 試劑

三氯甲烷、無(wú)水乙醇、二氯甲烷、石油醚：AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑優(yōu)先公司；咖啡因：AR，F(xiàn)ARCO CHEMICAL 提供；亞鐵氰化鉀：AR，天津市化學(xué)試劑三廠；堿式乙酸鉛：AR，天津市化學(xué)試劑三廠。

1.3 儀器

AE-100 電子分析天平：感量為0.000 1 g，梅特勒-托利多中國(guó)公司；UV-2401PC 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津公司；Anke TGL-10B 低速大容量離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；格蘭仕G70F20CN3L-C2HS3120型微波爐：格蘭仕集團(tuán)；超聲清洗器：長(zhǎng)沙科美分析儀器有限公司。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品0.050 00 g，用重蒸三氯甲烷溶解并定容至100.0 mL。取上述咖啡因溶液2.5 mL定容到25.0 mL 得到咖啡因工作液，分別取咖啡因工作液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，稀釋并定容至10.0 mL，得到質(zhì)量濃度分別為0.0、5.0、10.0、15.0、20.0 μg/mL的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.5 樣品處理

稱(chēng)取2.0 g（精確到0.000 1 g）粉碎混合均勻過(guò)60目篩樣品置于250.0 mL 三角瓶中，加80.0 mL 煮沸蒸餾水浸泡10.0 min 后，將三角瓶放到超聲波清洗器的盛水高度為40 mm 水槽中，超聲15 min 后，轉(zhuǎn)移到100.0 mL容量瓶中，加2.0mL200g/L 的亞鐵氰化鉀溶液和2.0 mL 200 g/L 的堿式乙酸鉛溶液除去茶葉中的蛋白質(zhì)，定容，過(guò)濾，濾液超聲脫氣后備用。液體樣品除蛋白，超聲脫氣后備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 最佳提取條件的篩選

2.1.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1.1 提取溶劑

咖啡因是存在于許多天然植物中的一類(lèi)屬于甲基黃嘌呤的生物堿，它在多種溶劑中的溶解性較好。因此，在茶、咖啡、飲料等體系中萃取咖啡因可用的溶劑種類(lèi)較多，三氯甲烷、二氯甲烷、石油醚和乙酸乙酯等均可用來(lái)萃取水相中的咖啡因[4]。按照1.5 樣品處理步驟，研究無(wú)水乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、石油醚和乙酸乙酯等溶劑對(duì)普洱茶咖啡因含量萃取效率的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明（見(jiàn)表1），幾種溶劑均能準(zhǔn)確分層，但三氯甲烷相對(duì)較好，且樣品分層速度快，提取率較大，選擇三氯甲烷作萃取溶劑。

表1 不同提取溶劑對(duì)咖啡因測(cè)定結(jié)果的影響Table 1 Effect of different extraction solvents on yield of caffeine content in black tea

2.1.1.2 三氯甲烷用量

取1.0 mL 樣液，分別添加5.0、10.0、15.0、20.0 mL三氯甲烷溶液經(jīng)離心萃取后，測(cè)定不同用量三氯甲烷對(duì)茶葉的咖啡因含量的影響。試驗(yàn)表明，由圖1 可知：三氯甲烷用量越大，咖啡因含量越高，但三氯甲烷屬有毒污染溶劑，按最少量原則和最佳的溶劑比確保樣液和萃取溶劑能準(zhǔn)確分層，最終選定15.0 mL。

圖1 三氯甲烷用量對(duì)紅茶咖啡因測(cè)定結(jié)果的影響Fig.1 Effect of chloroform dosage on yield of caffeine content in black tea

2.1.1.3 混配方式

固定其他條件不變，試驗(yàn)了自動(dòng)靜止混合、手動(dòng)混合、微波、離心等混配方式對(duì)萃取結(jié)果的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同提取方式對(duì)紅茶測(cè)定咖啡因測(cè)定結(jié)果的影響Table 2 Effect of different extraction method on yield of caffeine content in black tea

由試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，離心萃取的測(cè)定結(jié)果高于其他幾種混配方式。

2.1.1.4 離心提取速率和時(shí)間[6]

研究不同離心速率和時(shí)間對(duì)萃取結(jié)果的影響，離心速率和離心時(shí)間搭配分別為組合（1）：2 000 r/min，20 min；組合（2）：2 500 r/min，15 min；組合（3）：3 000 r/min，10 min；組合（4）：4 000 r/min，15 min。由試驗(yàn)結(jié)果（圖2）可見(jiàn)，離心速率為3 000 r/min，離心10 min 時(shí)咖啡因含量較高。

圖2 離心速率和離心時(shí)間對(duì)紅茶咖啡因結(jié)果的影響Fig.2 Effect of Centrifugal rate and time on yield of caffeine content in black tea

2.1.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，研究超聲提取時(shí)間（A）、三氯甲烷用量（B）、離心萃取速率（C）、離心萃取時(shí)間（D）等四因素三水平L9（34）正交試驗(yàn)，影響因素及水平見(jiàn)表3。

表3 咖啡因含量測(cè)定最佳因素水平表L9（34）Table 3 Level and factor of orthogonal test L9（34）

表4 咖啡因含量測(cè)定優(yōu)化篩選的試驗(yàn)方案Table 4 Orthogonal test of detemination caffine

正交試驗(yàn)結(jié)果表明，取樣量為2.0 g、超聲波水層深度為40 mm 時(shí)，最佳的提取條件為：超聲波輔助提取時(shí)間15.0 min、每毫升樣液三氯甲烷的用量為5.0 mL，離心萃取速率為2 500 r/min，離心萃取時(shí)間15.0 min。影響茶葉中咖啡因提取效果因素的主次順序?yàn)椋撼曁崛r(shí)間＞離心萃取時(shí)間＞離心萃取速率＞三氯甲烷用量。

2.2 方法的重復(fù)性試驗(yàn)

分別取普洱茶、綠茶、紅茶飲料、綠茶飲料等樣品，每個(gè)樣品測(cè)定7 次，計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)偏差及變異系數(shù)。本法的精密度分別為0.15%、0.75%、0.38%和0.88%。

2.3 加標(biāo)精密度試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已測(cè)定咖啡因含量普洱茶的樣品3 份，分別加人低、中、高3 種不同量的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品，按樣品溶液制備方法并進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表5。加標(biāo)回收率在98.56%～100.28%之間，符合分析測(cè)試要求。

表5 加標(biāo)回收率試驗(yàn)Table 5 Test of sandard addition

2.4 本法和標(biāo)準(zhǔn)法差異顯著性比較

選擇紅茶樣品，用本法和標(biāo)準(zhǔn)法分別進(jìn)行7 次平行測(cè)定，考察本法的精密度以及與表標(biāo)準(zhǔn)法的分析結(jié)果是否具有同一性。結(jié)果見(jiàn)表6（表中結(jié)果均為7 次測(cè)定紅茶樣品的平均值）。

表6 兩種方法的差異顯著性比較[7-8]（t 測(cè)試，顯著水平0.05）Table 6 Significant analysis of two methods

由差異顯著性比較結(jié)果可知（見(jiàn)表5）：本法和標(biāo)準(zhǔn)法之間差異的t 值為0.266，小于0.05 水平上的t值，即t=0.319＜t120.05，兩種方法測(cè)定結(jié)果差異不顯著，本法和標(biāo)準(zhǔn)法測(cè)定茶葉咖啡因含量，其結(jié)果具有同一性。

3 結(jié)論

1）采用超聲波預(yù)處理和離心萃取技術(shù)測(cè)定了茶葉及茶葉制品中咖啡因含量，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，當(dāng)稱(chēng)樣量為2.0 g、超聲波水層深度為40 mm 時(shí)，確定了最佳的提取條件為：超聲波提取時(shí)間15 min、三氯甲烷用量為15 mL，離心萃取速率為3 000 r/min，離心萃取時(shí)間10 min。萃取到的咖啡因三氯甲烷溶液加入適量的無(wú)水硫酸鈉去除樣品中的水分，用紫外分光光度計(jì)在275.0 nm 處測(cè)定茶葉及茶葉制品中咖啡因含量。

2）通過(guò)對(duì)法的重復(fù)性和加標(biāo)回收率試驗(yàn)，結(jié)果表明，本法的精密度和加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果良好，可以用于茶葉及茶葉制品咖啡因含量的測(cè)定。

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