基于亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒的細(xì)胞與活體成像＊

周 冰，王玉雙，楊淑娜，何曉曉，王柯敏

（湖南大學(xué)生物學(xué)院，化學(xué)生物傳感與計(jì)量學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，生物納米與分子工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410082）

在各種組織和器官都保持完整的狀態(tài)下有效地觀察腫瘤細(xì)胞進(jìn)入體內(nèi)的分布、遷徙等生物學(xué)行為離不開細(xì)胞標(biāo)記和體內(nèi)示蹤技術(shù)，這對(duì)于臨床醫(yī)學(xué)上腫瘤的判斷、治療和手術(shù)等有著重要的意義.在各種細(xì)胞標(biāo)記及活體示蹤技術(shù)中，熒光成像技術(shù)因其非侵入性及可重復(fù)性的特點(diǎn)而成為越來越多的研究者選擇的細(xì)胞標(biāo)記及體內(nèi)示蹤的方法[1］.傳統(tǒng)的細(xì)胞體內(nèi)成像主要依靠一些有機(jī)熒光染料，如熒光素異硫氰酸酯（FITC）、吲哚類菁染料等，它們由于具有較差的光穩(wěn)定性及半衰期短等缺點(diǎn)，從而在進(jìn)行高靈敏檢測及較長時(shí)間的細(xì)胞體內(nèi)成像研究中受到限制.發(fā)展合適的標(biāo)記成像探針已成為當(dāng)前細(xì)胞標(biāo)記與體內(nèi)成像研究的熱點(diǎn)之一.

隨著納米技術(shù)的發(fā)展，基于功能化熒光納米材料的標(biāo)記技術(shù)為細(xì)胞和活體標(biāo)記示蹤研究提供了新的思路.目前標(biāo)記、示蹤細(xì)胞和活體研究最多的納米材料主要有量子點(diǎn)[2］、熒光納米顆粒[3］等.相對(duì)于傳統(tǒng)熒光染料而言，量子點(diǎn)具有較好的量子產(chǎn)率、大的Stokes位移、好的抗光漂白能力與組織穿透力[4］.但是，使用量子點(diǎn)進(jìn)行活體成像的最大挑戰(zhàn)在于量子點(diǎn)長期毒性的不確定性[5］.二氧化硅熒光納米顆粒因合成過程更為簡便，對(duì)細(xì)胞的毒性要弱，生物相容性更好，可作為藥物載體達(dá)到細(xì)胞治療的目的等優(yōu)勢(shì)成為一種理想的成像探針并已經(jīng)在生物醫(yī)學(xué)成像研究中得到廣泛應(yīng)用[6］.如本研究小組在二氧化硅熒光納米顆粒的制備和應(yīng)用研究方面開展了系統(tǒng)的工作.利用油包水反向微乳液方法成功制備出多種包裹不同熒光染料（如RuBpy，Cy5.5和FITC等）的二氧化硅熒光納米顆粒，這些納米顆粒在分子和細(xì)胞層面的成像和檢測中得到了很好的應(yīng)用[7－10］.然而，針對(duì)活體這個(gè)特殊的研究對(duì)象，由于動(dòng)物體在可見光的激發(fā)下自身組織會(huì)有較強(qiáng)背景熒光，嚴(yán)重干擾目標(biāo)探針信號(hào)的準(zhǔn)確度和靈敏度，而在近紅外光區(qū)，生物組織對(duì)光的吸收較少，光的組織穿透力強(qiáng)，成像信背比相對(duì)較高[11－12］，從而使得近紅外二氧化硅熒光納米顆粒成為細(xì)胞標(biāo)記與活體成像的理想材料之一.

目前所報(bào)道的包裹近紅外熒光染料種類較少而成本相對(duì)較高，亞甲基藍(lán)是一種廉價(jià)的近紅外染料，并且已用于生物樣品的熒光分析中[13］.本文采用反相微乳液法，制備以亞甲基藍(lán)為內(nèi)核材料的亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒，通過優(yōu)化亞甲基藍(lán)的包裹濃度獲得熒光信號(hào)較強(qiáng)的納米顆粒.通過MTT實(shí)驗(yàn)來考察顆粒對(duì)細(xì)胞的毒性效果以及較為適宜的標(biāo)記細(xì)胞的濃度.利用激光共聚焦顯微鏡來考察Hela細(xì)胞對(duì)顆粒的吞噬情況以及顆粒在細(xì)胞內(nèi)的分布情況，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過活體熒光成像系統(tǒng)考察顆粒體內(nèi)示蹤成像的可行性.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑及儀器

二甲基亞砜（DMSO，北京，鼎國公司）；正硅酸乙酯（TEOS，廣東汕頭市西隴化工廠）；Triton X－100（上海生物工程有限公司）；環(huán)己烷、正己醇（上海化學(xué)試劑公司）；亞甲基藍(lán)（美國，sigma公司）；戊巴比妥鈉（美國，sigma公司）；LysoTracker Green DND 26（美國，Invitrogen公司）；RPMI 1640無血清培養(yǎng)基（美國，GIBCO公司）；實(shí)驗(yàn)用水為超純水（18.2MΩ）；PBS緩沖液、D－Hank’s液均為自配；宮頸癌細(xì)胞系（Hela）由本實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞中心提供.

高速離心機(jī)（日本，Hitachi公司）；透射電子顯微鏡（日本，JEOL公司）；酶聯(lián)免疫檢測儀（美國，Bio－Rad公司）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國，Nuair公司）；掃描激光共聚焦顯微 鏡 （日 本，Olympus 公 司）；Malvern Zetasizer 3000HS粒度分析儀（英國，Malvern公司）；Maestro CRI熒光活體成像儀（美國，Maestro公司）.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒的制備

包裹亞甲基藍(lán)的二氧化硅納米顆粒是根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的油包水反相微乳液法進(jìn)行制備[14］，即將環(huán)己烷（7.5mL）、正己醇（1.6mL）和 Triton X－100（1.8 mL）混合，攪拌5min至澄清，然后加入480μL一定濃度的亞甲基藍(lán)水溶液作為分散相，常溫下攪拌30min，形成油包水的微乳液體系，隨后加入一定量的濃氨水和正硅酸乙脂，室溫反應(yīng)24h.反應(yīng)結(jié)束后用無水乙醇破乳，離心收集顆粒，然后用無水乙醇和水分別洗滌數(shù)次后，將顆粒分散在超純水中，于室溫下暗處儲(chǔ)存?zhèn)溆?

1.2.2 亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒的吸收光譜和熒光光譜測定

采用紫外可見分光光度計(jì)分別測定了純亞甲基藍(lán)溶液和亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒的吸收光譜情況.采用活體熒光成像儀測定了亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒的熒光發(fā)射光譜及熒光成像圖.

1.2.3 亞甲基藍(lán)包裹濃度的優(yōu)化

為優(yōu)化亞甲基藍(lán)溶液的最佳包裹濃度使顆粒的熒光強(qiáng)度達(dá)到最高，在反應(yīng)體系中分別加入2mg/mL，2.5mg/mL，3mg/mL，3.5mg/mL，4 mg/mL和5mg/mL的亞甲基藍(lán)溶液制備得到包裹不同濃度的亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒.利用活體熒光成像儀測定包裹不同亞甲基藍(lán)濃度的亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒的整體熒光成像圖.

1.2.4 亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒的濃度測定

采用差量法對(duì)制備的亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒進(jìn)行定量.具體操作如下：（a）首先將一個(gè)干凈的1.5mL離心管置于烘箱內(nèi)烘干過夜，稱其重為W1（mg），然后每天稱重一次直至其重量不再變化為止，記為W2（mg）；（b）將制備出的亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒懸浮液混合均勻后，取200μL加入到已知重量的小離心管中，稱重后記為W3，然后將離心管放置于真空冷凍干燥儀中進(jìn)行冷凍干燥，干燥后的重量記為W4（mg）.則熒光納米顆粒的濃度可用下述公式來計(jì)算：

1.2.5 亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒的電鏡和電勢(shì)表征

采用透射電子顯微鏡對(duì)亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒的大小和形貌進(jìn)行表征 .具體步驟為：將亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒懸浮在適量超純水中，超聲分散后，將顆粒水溶液滴加在福爾馬膜銅網(wǎng)上，自然干燥后用透射電子顯微鏡觀察拍照.同時(shí)用Zeta電位粒度儀測量二氧化硅熒光納米顆粒的表面電勢(shì)，具體步驟為：亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒懸浮液按儀器測定濃度范圍進(jìn)行稀釋，再置于超聲波中超聲分散后進(jìn)行測定.

1.2.6 亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒的細(xì)胞毒性考察

通過MTT實(shí)驗(yàn)考察一系列濃度（0.1mg/mL～2 mg/mL）亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒對(duì)Hela細(xì)胞的毒性作用.MTT實(shí)驗(yàn)原理為：活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠代謝還原MTT，同時(shí)在細(xì)胞色素C的作用下，生成藍(lán)紫色不溶于水的甲臜，甲臜的生成量與活細(xì)胞數(shù)成正比，加入二甲基亞砜（DMSO）溶解甲臜后可以用酶標(biāo)儀在570nm處進(jìn)行測定，利用所測吸光度推算出活細(xì)胞的數(shù)目.具體操作步驟為：收集對(duì)數(shù)期的Hela細(xì)胞以每孔5 000～10 000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔體積200μL，然后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).待細(xì)胞貼壁生長24h后取出96孔板，向其中加入已滅菌的二氧化硅熒光納米顆粒（初始濃度約12mg/mL），使其在Hela細(xì)胞培養(yǎng)液中的最后濃度分別為0.1，0.2，0.4，0.8，1，1.6，2mg/mL.待顆粒與培養(yǎng)液充分混勻后將96孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，熒光納米顆粒與Hela細(xì)胞共孵育24h后取出培養(yǎng)板，在每孔中加入10μL 5mg/mL的MTT，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后取出96孔板并快速取出孔內(nèi)液體，再每孔加入150μL DMSO，置于酶標(biāo)儀中震蕩反應(yīng)10min后測定其在570nm處的吸光度值.每個(gè)濃度梯度設(shè)5個(gè)重復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.采用細(xì)胞存活率來體現(xiàn)不同濃度納米顆粒對(duì)細(xì)胞毒性的大?。?/p>

1.2.7 亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒用于活體成像

在顆粒進(jìn)行Hela細(xì)胞示蹤成像之前，首先對(duì)顆粒的活體熒光成像情況進(jìn)行考察.具體步驟為：取兩組裸鼠，每只裸鼠在實(shí)驗(yàn)時(shí)，肌肉注射50μL的異丙嗪，30min后再按照80mL/20g劑量進(jìn)行腹腔注射濃度為2%戊巴比妥鈉，等到完全麻醉后從尾靜脈注射12.5mg/mL的亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒200μL，取不同的時(shí)間點(diǎn)對(duì)小鼠進(jìn)行活體成像，觀察體內(nèi)熒光分布變化情況.活體成像系統(tǒng)采用635nm的紅光激發(fā)，680nm～800nm收集，曝光時(shí)間1 000 ms.（所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均遵守湖南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和保護(hù)規(guī)章制度，許可證：NO.SYXK（湘）2008－0001）.共重復(fù)3次.取第2組裸鼠作為對(duì)照，不注射亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒，重復(fù)3次.實(shí)驗(yàn)中所使用的裸鼠均為4～6周齡，體重在15～20g之間，裸鼠用屏蔽的動(dòng)物隔離器飼養(yǎng)，溫度控制在28℃左右，濕度在40%左右，飼養(yǎng)條件完全按照裸鼠飼養(yǎng)條件進(jìn)行飼養(yǎng).

為了對(duì)活體熒光成像結(jié)果的準(zhǔn)確性進(jìn)行證實(shí)，在尾靜脈注射亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒90min后對(duì)裸鼠進(jìn)行解剖，取出其部分器官進(jìn)行熒光成像.將未注射的裸鼠同時(shí)解剖作為對(duì)照，同樣對(duì)解剖后的裸鼠和取出的相應(yīng)器官進(jìn)行熒光成像.器官的擺放按照從上到下、從左至右的順序依次為：無食物殘?jiān)男∧c、膀胱、腎臟、脾臟、心臟、肺、皮膚、肝臟、肌肉、含食物殘?jiān)拇竽c.

為了進(jìn)一步驗(yàn)證活體熒光成像結(jié)果，對(duì)裸鼠、亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒、裸鼠飼料同時(shí)進(jìn)行活體熒光成像考察.活體成像系統(tǒng)采用615～665nm的紅光激發(fā)，680～800nm收集，曝光時(shí)間200ms.

2 結(jié)果與討論

2.1 亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒的制備及亞甲基藍(lán)濃度的優(yōu)化

通過反相微乳液法制備了亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒.為了考察亞甲基藍(lán)是否包裹進(jìn)二氧化硅納米顆粒內(nèi)，采用紫外可見分光光度計(jì)來考察純亞甲基藍(lán)染料和亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒在水相中的吸收光譜，采用活體成像儀測定亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒的熒光發(fā)射光譜.結(jié)果如圖1所示，純亞甲基藍(lán)染料的紫外最大吸收峰約為650nm，制備成亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒的最大吸收峰藍(lán)移至620 nm左右，沒有很大改變.通過對(duì)顆粒的熒光發(fā)射光譜測定可以看出，亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒的最大發(fā)射峰大約在710nm.這些吸收峰和發(fā)射峰都在近紅外區(qū)域，說明已成功制備了亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒.這為能更靈敏的進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記和活體示蹤成像奠定了一定的基礎(chǔ).從顆粒的熒光成像圖可以看出亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒具有較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度.此結(jié)果表明亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒能夠?yàn)轶w內(nèi)示蹤成像提供較好的熒光信號(hào).

圖1 顆粒的光譜性和熒光成像圖Fig.1 The spectroscopic properties and fluorescence images of the nanoparticles

亞甲基藍(lán)雖然有熒光但是其熒光量子產(chǎn)率不是很高，并且容易發(fā)生熒光自淬滅.為了獲得熒光信號(hào)較強(qiáng)的亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒，對(duì)亞甲基藍(lán)的包裹濃度進(jìn)行了優(yōu)化.活體熒光成像結(jié)果如圖2所示，隨著亞甲基藍(lán)包裹濃度的不斷增大，顆粒溶液的熒光強(qiáng)度呈先增強(qiáng)后逐漸減弱的趨勢(shì).顆粒溶液的熒光信號(hào)開始逐漸增強(qiáng)是因?yàn)閬喖谆{(lán)濃度的增大，而隨著亞甲基藍(lán)濃度的進(jìn)一步增強(qiáng)，顆粒內(nèi)包裹的亞甲基藍(lán)分子越來越多，分子間的距離越來越近，熒光自淬滅效應(yīng)增強(qiáng)從而導(dǎo)致信號(hào)的減弱.從圖中也可以看出，當(dāng)亞甲基藍(lán)溶液的濃度為3mg/mL時(shí)，顆粒的熒光信號(hào)最強(qiáng)，所以亞甲基藍(lán)的包裹濃度確定為3mg/mL.

圖2 亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒的活體熒光圖Fig.2 The fluorescence images of prepared MB－SiNPs

2.2 亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒電鏡和電勢(shì)表征

利用透射電子顯微鏡（TEM）對(duì)制備的熒光信號(hào)最強(qiáng)的亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒的大小和形貌進(jìn)行了表征，結(jié)果如圖3所示.從圖中可以看出顆粒的大小均勻、分散性好、粒徑約73nm，呈明顯球形.Zeta電位粒度儀分析結(jié)果表明，亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒的表面電勢(shì)為－28.9mV.

圖3 亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒的透射電子顯微鏡圖Fig.3 The transmission electron microscope（TEM）images of prepared MB－SiNPs.

2.3 亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒的細(xì)胞毒性考察

亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒對(duì)Hela細(xì)胞的毒副作用主要通過細(xì)胞的存活率來考察.結(jié)果如圖4所示：在亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒與Hela細(xì)胞共孵育24 h后，當(dāng)顆粒的濃度為1mg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率仍在80%左右.隨著顆粒濃度的增大，細(xì)胞的存活率逐漸降低，顆粒對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了一定的毒性.此結(jié)果表明：亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒對(duì)Hela細(xì)胞的毒性作用存在一定的濃度依賴性，毒性強(qiáng)度隨著顆粒濃度的增大而逐漸增強(qiáng)，但是當(dāng)與Hela細(xì)胞作用的顆粒濃度在1mg/mL范圍內(nèi)時(shí)，細(xì)胞存活率都維持在80%以上，因此可以用濃度為1mg/mL的亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒來對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記實(shí)驗(yàn).

圖4 不同濃度的亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒對(duì)Hela細(xì)胞存活率的影響Fig.4 The cell viability assay of Hela in the presence of different concentrations of MB－SiNPs using MTT assay

2.4 亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒用于Hela細(xì)胞熒光成像

為了考察亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒是否可以作為Hela細(xì)胞的標(biāo)記物，考察了Hela細(xì)胞對(duì)亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒的吞噬情況以及顆粒在細(xì)胞內(nèi)的分布情況.如圖5所示，亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒能夠被Hela細(xì)胞吞噬，并且攝取大量顆粒后的Hela細(xì)胞依然能夠保持較好的細(xì)胞形態(tài).采用溶酶體標(biāo)記物對(duì)溶酶體進(jìn)行標(biāo)記，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒的熒光信號(hào)能夠與溶酶體標(biāo)記物的熒光信號(hào)共定位，表明納米顆粒會(huì)被Hela細(xì)胞攝取，主要分布在溶酶體部位.以上結(jié)果表明，亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒可以作為Hela細(xì)胞的有效標(biāo)記物.

圖5 Hela細(xì)胞對(duì)亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒的吞噬情況Fig.5 Confocal laser scanning microscopy（CLSM）images of Hela cells after incubated with MB－SiNPs

2.5 亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒用于活體熒光成像

為了考察亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒是否可以作為體內(nèi)示蹤劑，首先考察了沒有標(biāo)記細(xì)胞的純亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒的熒光活體成像情況.將一定量的亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒從尾靜脈注射入裸鼠體內(nèi)，然后對(duì)其在裸鼠體內(nèi)的成像效果進(jìn)行考察.結(jié)果如圖6，以沒有注射亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒的裸鼠熒光情況作為信號(hào)對(duì)照，注射亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒10min后，隨著全身血液循環(huán)，裸鼠全身都發(fā)射出熒光信號(hào)，然后信號(hào)慢慢聚集在肝臟等器官中.這一結(jié)果說明亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒具備進(jìn)行活體熒光成像的可行性.但是從對(duì)照?qǐng)D（0min）可以看出，即使未注射亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒，裸鼠腹腔部位也有著明顯的信號(hào)，降低了成像的靈敏度.

圖6 尾靜脈注射亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒的實(shí)時(shí)活體熒光成像圖Fig.6 Real－time in vivo abdomen imaging of nude mice intravenously injected with MB－SiNPs

為進(jìn)一步考察活體熒光成像結(jié)果以及裸鼠腹腔熒光信號(hào)的來源，我們將注射了亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒后90min的老鼠進(jìn)行解剖，并得到解剖器官的熒光成像圖.如圖7（A）所示，在器官成像圖中，從左至右、從上至下依次為無食物的小腸、膀胱、腎臟、脾臟、心臟、肝臟、皮膚、肺、肌肉、帶食物的大腸.從圖7（A1－A2）中可以看出，注射亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒后解剖器官中肝臟和脾臟有著明顯的熒光信號(hào)，這一結(jié)果證明了活體熒光成像的準(zhǔn)確性.但是從圖7（A3）中可以看到大腸也有著很強(qiáng)的熒光信號(hào).基于此結(jié)果，我們猜測對(duì)照裸鼠腹部的熒光信號(hào)主要來自于裸鼠的食物.為了證實(shí)這一猜測，我們對(duì)裸鼠，亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒及裸鼠飼料進(jìn)行了活體熒光成像.結(jié)果如圖7（B）所示，裸鼠腹部有很強(qiáng)的熒光信號(hào)，而裸鼠飼料的熒光信號(hào)強(qiáng)度跟我們制備的顆粒的熒光強(qiáng)度性質(zhì)類似，這說明了裸鼠食物也是可以被紅光激發(fā)而發(fā)射出近紅外光信號(hào).這一結(jié)果證實(shí)了前面的假設(shè)，對(duì)照裸鼠腹部的強(qiáng)熒光信號(hào)來自于食物.

圖7 （A）未注射（A1）與注射了（A2，A3）亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒的裸鼠離體器官成像圖；（B）：裸鼠自發(fā)熒光成像圖.a：裸鼠飼料；b：亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒Fig.7 （A）Ex vivo imaging of dissected organs from the nude mice without（A1）and with（A2，A3）injection of MB－SiNPs；（B）Autofluorescence imaging of nude mice.a：the mouse chow；b：MB－SiNPs

基于以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以得出本文制備的亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆?？梢杂糜诩?xì)胞標(biāo)記及體內(nèi)示蹤成像，但要想進(jìn)行高靈敏的熒光成像，必須要解決裸鼠食物熒光信號(hào)對(duì)目標(biāo)信號(hào)的干擾.因此在設(shè)計(jì)近紅外熒光探針來進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記及活體成像研究中，不僅要考慮降低可見光區(qū)裸鼠的組織自發(fā)熒光還要考慮降低近紅外光區(qū)裸鼠食物的熒光信號(hào).

3 結(jié) 論

本文通過優(yōu)化亞甲基藍(lán)的包裹濃度獲得了熒光信號(hào)較強(qiáng)的亞甲基藍(lán)二氧化硅納米顆粒，并初步考察了該顆粒的Hela細(xì)胞標(biāo)記成像和活體熒光成像.結(jié)果表明，包裹亞甲基藍(lán)的二氧化硅納米顆?？梢杂糜诩?xì)胞標(biāo)記和體內(nèi)示蹤成像.但是由于在相同的成像條件下，裸鼠食物的熒光信號(hào)也很強(qiáng)，干擾了成像的靈敏度.因此，發(fā)展一種能同時(shí)克服裸鼠組織自發(fā)熒光與裸鼠食物熒光信號(hào)的成像探針對(duì)于進(jìn)行高靈敏的細(xì)胞標(biāo)記及體內(nèi)示蹤成像具有重要的意義，這有待于進(jìn)一步的研究.

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