滸苔多糖的酶法提取、純化及初步結構鑒定

呂海濤，肖寶石，高玉杰

（青島農(nóng)業(yè)大學化學與藥學院，山東 青島 266109）

滸苔具有多種營養(yǎng)成分，是一種高蛋白、低脂肪，且富含維生素和礦物質(zhì)的優(yōu)質(zhì)海洋食品[1-2]，是食藥兩用藻類。滸苔在我國野生藻類中資源豐富，其自然繁殖能力特別強，滸苔大面積的爆發(fā)會對沿海交通和海洋生態(tài)環(huán)境造成嚴重影響。滸苔多糖是滸苔的主要活性物質(zhì)之一，主要具有抗腫瘤、降低血脂、膽固醇、提高機體免疫力、抗菌、抗病毒、消炎等功效[3-5]。

目前，對于滸苔多糖的提取、純化和結構鑒定方面已有一些報道[6-8]，但多不系統(tǒng)。本文利用蛋白酶將糖蛋白的化學鍵打斷，提高多糖粗產(chǎn)品的得率和蛋白質(zhì)的脫除率，并能最大限度的保持多糖的生理活性，經(jīng)過分離純化得到其主要活性成分，并進行初步的結構分析，為更好的開發(fā)滸苔資源、進一步深入研究滸苔多糖的生理活性及作用機理奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

滸苔：采于青島匯泉灣。

DEAE-52：Whatman 公 司；Sephadex G-100：GE Healthcare 公司；木瓜蛋白酶（65 萬μ/g）：廈門星隆達化學試劑有限公司；牛血清蛋白、葡萄糖（Glc）、甘露糖（Man）、鼠李糖（Rha）、木糖（Xy）：Sigma 公司；考馬斯亮藍G-250：上海試劑三廠；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）、氯化鈉、氫氧化鈉、苯酚、濃硫酸（分析純）：天津巴斯夫化工有限公司；醋酸銨、濃硫酸、鹽酸（分析純）：萊陽市康德化學有限公司；無水乙醇（分析純）：青島化學試劑廠；乙腈（色譜純）：天津市津東天正精細化學試劑廠。

90-2 醫(yī)用低速離心機：江蘇省金壇市恒豐儀器廠；Delta320 pH 計：梅特勒-托利多儀器有限公司；AR2140 電子天平：賽多利斯科學儀器有限公司；SP-754 紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；HH-S 恒溫水浴鍋：金壇市金城國際實驗儀器廠；RE－52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；LC 10A Tvp液相色譜儀：島津公司；Eclipse XDB-C18 色譜柱（5 μm 4.6×150 mm）：安捷倫科技公司；N2000 工作站：浙江大學；Cascada 超純水系統(tǒng)（Pall Corporation），真空冷凍干燥機：德國Martin Christ 公司。

1.2 方法

1.2.1 滸苔粗多糖的提取

取一定量的滸苔粉，加入10 倍量的95%乙醇，回流2 h，除去脂類、單糖及其它醇溶性成分（生物堿、黃酮苷、多酚、氨基酸等），抽濾后，用無水乙醇、丙酮洗滌，干燥。

取脫脂后滸苔干粉5 g，料液比1∶50（g/mL），溫度80 ℃，水提4 h 后冷卻至室溫；再加入400 mg 木瓜蛋白酶，調(diào)pH 5.5，60 ℃酶解3 h，95 ℃滅酶15 min。過濾，濾液濃縮至體積的1/3，加入4 倍體積無水乙醇，放入冰箱，過夜。抽濾，將沉淀60 ℃下烘干，得滸苔粗多糖。采用苯酚-硫酸法[9]測定總糖含量，采用考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量[10]。滸苔多糖的平均得率是27.75%，純度為50.03%，蛋白含量為0.78%。

1.2.2 滸苔粗多糖的分離純化

稱取0.5 g 滸苔粗多糖用少量雙蒸水溶解，離心，取上清液在DEAE-52 纖維素柱分離，分別用2 倍柱體積雙蒸水、0.1 mol/L NaCl、0.3 mol/L NaCl、0.5 mol/L NaCl 淋洗，每3 mL 收集一管，流速為0.6 mL/min，收集洗脫液。每管取少量進行苯酚-硫酸法顯色，在490 nm測其OD 值，以試管數(shù)目為橫坐標，吸光度為縱坐標做洗脫曲線。分別將最大峰處的洗脫液合并，減壓濃縮，流水透析3 d，透析袋內(nèi)的多糖溶液真空冷凍干燥，得多糖EP1、EP2、EP3和EP4。

1.2.3 EP1 純度檢驗

取200 mg EP1，用少量蒸餾水溶解，裝入Sephadex G-100 柱分離，用蒸餾水洗脫，每3 毫升收集一管，流速為0.4 mL/min。洗脫液用苯酚-硫酸法顯色，490 nm測其OD 值，繪制洗脫曲線。

1.2.4 EP1 紫外光譜和紅外光譜分析

配制一定濃度的EP1多糖溶液，在180 nm～640 nm波長間進行掃描。

稱取干燥的2 mg EP1，與200 mg 干燥的KBr 粉末在瑪瑙研缽中細細研磨均勻，經(jīng)壓片機壓片，在4 000 cm-1～400 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)掃描。

1.2.5 滸苔多糖EP1 單糖分析

稱取20 mg EP1 于10 mL 具塞試管內(nèi)，加入2 mL 2 mol/L H2SO4，100 ℃水解8 h。用4 mol/L NaOH 水溶液中和至pH7.0，并用水稀釋到5 mL，離心，取上清液備用。

精密吸取滸苔多糖水解液100 μL 置于離心管中，分別加入100 μL 0.5 mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）甲醇溶液和0.3 mol/L NaOH 溶液，混勻后于70 ℃水浴中反應30 min，取出后在4 ℃下冷卻10 min，用100 μL 0.3 mol/L HCl 溶液中和，用1 mL 氯仿萃取，充分震蕩搖勻，4 500 r/min 離心10 min，棄去有機層，水層萃取3 次，待用。

利用高效液相色譜對衍生后的多糖樣品進行分離測定，流動相：1.0 mol/L 醋酸銨緩沖液（pH 6.7）-乙腈（86∶14，體積分數(shù)）；流速：1 mL/min；檢測波長：245 nm。

2 結果與討論

2.1 DEAE-52 層析柱對滸苔粗多糖分級

滸苔粗多糖經(jīng)過DEAE-52 柱層析后，將同一洗脫峰收集合并，透析，冷凍干燥，分別得到四種多糖EP1、EP2、EP3、EP4，見圖1。

圖1 滸苔多糖EP1的DEAE-52 柱洗脫曲線Fig.1 Elution curve of Enteromorpha polysaccharide on DEAE-52 column

其中EP1的洗脫液為蒸餾水，EP2的洗脫液為0.1 mol/L NaCl，EP3的洗脫液為0.3 mol/L NaCl，EP4的洗脫液為0.5 mol/L NaCl。所得滸苔多糖EP1為白色絮狀物，無臭無味，溶于水，不溶于高濃度的乙醇、乙醚、丙酮、乙酸乙酯等有機溶劑。硫酸蒽酮法、苯酚硫酸法顯色反應均為陰性，EP1的產(chǎn)率為73.22%。

2.2 Sephadex G-100 層析柱對EP1的分離純化

滸苔多糖經(jīng)過層析柱分離后，EP1的得率明顯高于其他組分，本文確定EP1為研究對象。圖2 為Sephadex G-100 層析柱對EP1 的純化曲線。

圖2 滸苔多糖EP1的Sephadex G-100 洗脫曲線Fig.2 Polysaccharide EP1Sephadex G-100 chromatography curve

由圖2 可見只有一個洗脫峰，且峰型對稱，因此EP1為同一組分。收集洗脫峰，透析，冷凍干燥，得到EP1純品，測得回收率為95.35%，純度為99.69%。

2.3 EP1紫外光譜

EP1組分在180 nm～640 nm 波長間掃描，結果顯示在260 nm 和280 nm 處沒有吸收峰，說明此多糖不含核酸和蛋白質(zhì)。

2.4 EP1的紅外光譜

EP1的紅外光譜，見圖3。

圖3 EP1的紅外光譜圖Fig.3 IR spectra of EP1

圖3 為EP1 的紅外光譜圖，3 445.89 cm-1處有強且寬的-OH 吸收峰，是多糖上羥基伸縮振動吸收峰；2 917.77 cm-1附近的峰為飽和C-H 伸縮振動（為-CHCH2 的吸收峰）信號；1 635.94 cm-1附近為糖醛酸殘基中羧基的C=O 伸縮振動吸收峰；1 421.28 cm-1代表了C-O 的伸縮振動或者C-H 及O-H 的彎曲振動；1 258.53 cm-1的強峰為硫酸基的S=O 對稱伸縮振動吸收峰；1 046.85 cm-1的強寬吸收峰為糖苷鍵或環(huán)內(nèi)C-O 伸縮振動吸收峰，766 cm-1處出的峰為吡喃糖環(huán)的伸縮振動。紅外光譜表明EP1 具有多糖的特征吸收峰及硫酸基存在。

3.5 滸苔多糖單糖分析

滸苔多糖單糖分析，見圖4。

圖4 4 種單糖標準品（a）和滸苔多糖EP1（b）的HPLC 色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of four monosaccharide standards（a）and EP1（b）

圖4 為標準糖樣中單糖的液相色譜圖與滸苔多糖的液相色譜圖。二個圖譜對照，可以確定滸苔多糖EP1主要是由葡萄糖構成，還含有一定量的鼠李糖以及少量的木糖和甘露糖，經(jīng)外標法計算得知甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、木糖的比例是0.09∶1.0∶3.1∶0.29。

4 結論

以青島海域滸苔為原料，對滸苔多糖的酶法提取、分離純化和結構分析進行了系統(tǒng)研究。利用熱水-木瓜蛋白酶法從滸苔中提取多糖，采用DEAE-52 纖維素柱分離得到4 種系列多糖EP1、EP2、EP3和EP4。其中EP1是均一的主要成分，具有多糖的特征吸收峰及硫酸基，不含有核酸和蛋白質(zhì)，其單糖組成為：甘露糖∶鼠李糖∶葡萄糖∶木糖=0.09∶1.0∶3.1∶0.29。本文為滸苔多糖的進一步結構改造，如硒化多糖、稀土化多糖及其抗病毒、抗腫瘤生物活性實驗等提供一定的基礎。

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