烏賊墨多糖的體外抗氧化作用

羅萍，師莉莎，劉華忠

（1.廣東海洋大學食品科技學院，廣東 湛江 524088；2.廣東海洋大學生物化學中心，廣東 湛江 524088）

我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥對烏賊墨悠遠的醫(yī)用史實要追溯到《神農(nóng)本草經(jīng)》，“可收斂止血，固精止帶，制酸定痛，除濕斂瘡”?！侗静菔斑z》描述烏賊“腹中墨，主治血刺心痛”?，F(xiàn)代大量的研究結果證實，烏賊墨是一種多功能海洋活性物質(zhì)，如止血[1]、抗腫瘤[2]、抗菌[3]、抗輻射[4]、升白[5]、抗氧化[6-9]，等。筆者所在實驗室對烏賊墨的化療保護作用進行了大量的研究工作，發(fā)現(xiàn)烏賊墨對化療藥物環(huán)磷酰胺致模型動物多種正常組織損傷均具有較強的緩解效應。烏賊墨是一種黑色混合物，其中主要成分為糖類、蛋白質(zhì)、脂類等有機大分子和游離氨基酸、黑色素等有機小分子，除此，墨中還含有多種微量元素。因此，我們對前期研究對烏賊墨中發(fā)揮化療保護作用的有效成分進行了篩選，發(fā)現(xiàn)烏賊墨多糖便是活性成分之一。

對烏賊墨多糖的研究，最早見于日本研究人員的報道。日本學者率先對烏賊墨多糖的組成與結構進行了探討，他們的研究結果表明，多糖鏈為帶有分支結構的糖胺聚糖（GAG），主鏈為葡萄糖醛酸—海藻糖（GlcA-Fuc）二糖單元的串聯(lián)重復，N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）分支于海藻糖，完整的三糖重復單元為{-3GlcAβ1-4（GalNAcα1-3）Fucα1-}n[10]，該結果被我國的研究人員再次確證[11]。目前，對烏賊墨多糖活性研究的報道十分鮮見。我們近年來的研究發(fā)現(xiàn)，烏賊墨多糖是烏賊墨中發(fā)揮化療保護作用的主要成分，能顯著緩解環(huán)磷酰胺對模型動物造成的毒性損傷[12]。環(huán)磷酰胺的細胞毒性原因之一，是因為環(huán)磷酰胺在肝臟的代謝產(chǎn)物所誘導的氧化應激所致。在我們前期的研究中，烏賊墨多糖能顯著弱化環(huán)磷酰胺所介導的氧化性損傷，提升機體的抗氧化能力[12]。因此，烏賊墨多糖的化療保護效應與其弱化環(huán)磷酰胺誘導的氧化應激有關。為進一步探討烏賊墨多糖的抗氧化作用，本試驗檢測了烏賊墨在體外的抗氧化能力。研究結果將為促進烏賊墨在保健功能食品領域的研究與開發(fā)提供有效的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

烏賊墨多糖為本室制備[13-14]。

乙二胺四乙酸二鈉：廣州化學試劑廠；鐵氰化鉀：天津市巴斯夫化工有限公司；鄰苯三酚、DPPH：上海華藍化學科技有限公司；WFZ UV-2800 AH 型紫外分光光度計：尤尼柯儀器有限公司。

1.2 總還原力測定[15]

待測樣品、磷酸緩沖液（PBS，pH6.6，2.5 mol/L）和1%K3Fe（CN）6溶液各取2.0 mL 混合，50 ℃水浴20 min，冰水冷卻后加入2.0 mL 三氯乙酸溶液（10%，TCA）混勻。3 000 r/min 離心10 min 后取上清2.0 mL，依次加入蒸餾水2.0 mL、0.1%FeCl3溶液0.4 mL，混勻靜置10 min。蒸餾水參照，測定A700nm。

1.3 羥自由基清除力測定[16]

取3.0 mL Tris 緩沖液（0.15 mol/L，pH8.2）、1.0 mL溴鄰苯三酚紅（1 mmol/L） 和1 mL EDTA-Na2-Fe（1.0 mmol/L）混合，再加入多糖試樣1.0 mL，最后加入1.0 mL 2%H2O2，混勻后放置30 min?？瞻滓哉麴s水代替試樣，對照組以蒸餾水代試樣和EDTA-Na2-Fe，測定A520nm。清除率=（A空白－A樣液）÷A空白×100%。

1.4 DPPH 自由基清除力測定[17]

取2.0 mL 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼溶液（0.2 μmol/L，DPPH）與2.0 mL 樣品混合均勻，在黑暗中放置30 min，測定A517nm。清除率=[（Ac-Ai）/Ac]×100 %（Ac：無水乙醇+DPPH 溶液的吸光度；Ai：待測液+DPPH 溶液的吸光度）。

1.5 總抗氧化能力測定[17]

標準曲線：取6.08 mg FeSO4溶于適量的水中，加入H2SO4（18 mol/L）0.25 mL，再用蒸餾水定容至50.0 mL，并置入小鐵釘。取上述溶液5.0 mL，蒸餾水定容至50.0 mL，即為800 μmol/L FeSO4標準溶液。蒸餾水倍比稀釋標準溶液，制備400、200、100、50、25 μmol/L 標準溶液，測定A593nm，繪制標準曲線。

總抗氧化能力測定：取0.3 mL 樣品加入2.7 mL 預熱至37 ℃的三價鐵還原抗氧化能力（FRAP）工作液，混勻放置10 min，測定A593nm。樣品分別作1、2、5 倍3個稀釋度，以無水乙醇代替樣品加入FRAP 工作液作為空白，每個稀釋度做10 次平行試驗，求平均值。根據(jù)反應后吸光值，計算相應FeSO4的濃度（μmol/L），定義為FRAP 值。

1.6 數(shù)據(jù)分析

2 結果與分析

2.1 烏賊墨多糖對DPPH 自由基的清除作用

DPPH 是一種穩(wěn)定的有機自由基，其穩(wěn)定性源于苯環(huán)的空間障礙，使處于中心部位的氮原子上孤電子不能成對?；贒PPH 的單電子在517 nm 處有一強吸收，且其醇溶液呈紫色的特性。當有自由基清除劑存在時，由于單電子配對而使吸收逐漸衰減，褪色程度與接受的電子數(shù)量成定量關系，因而可用分光光度計進行快速的定量分析。因此，DPPH 法自1958 年建立以來，廣泛用于測定生物試樣和食品的抗氧化能力。本研究采用DPPH 法測定了烏賊墨多糖體外對DPPH自由基的清除能力，檢測數(shù)據(jù)詳見圖1。

圖1 SIPG 對DPPH 自由基的清除能力Fig.1 Scavenging rates of SIPG at the indicated concentrations against DPPH free radicals

結果表明，在所設定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，對DPPH自由基的清除能力與烏賊墨多糖的濃度呈現(xiàn)劑量依賴關系，隨著烏賊墨多糖濃度的等量遞增，DPPH 自由基的清除率逐漸上升，當質(zhì)量濃度達到所定最大值（14.25 mg/mL）時，對DPPH 自由基的清除能力也達到最大值。各質(zhì)量濃度間均有極顯著差異（P<0.01）。

2.2 烏賊墨多糖的總抗氧化能力

FRAP 法是一種簡便快捷的測定樣品總抗氧化能力的方法。其原理是在酸性條件下，抗氧化物可以還原Fe3+-TPTZ（Ferric-tripyridyltriazine） 產(chǎn)生藍色的Fe2+-TPTZ，隨后在593 nm 測定藍色的Fe2+-TPTZ 即可獲得樣品中的總抗氧化能力。由于反應在酸性條件下進行，可以抑制內(nèi)源性的一些干擾因素。由于樣品中Fe3+或Fe2+的總量常低于10 μmol/L，因此樣品中Fe3+或Fe2+不會明顯干擾FRAP 法的檢測反應。另外，反應體系中的Fe3+或Fe2+是和TPTZ 螯合的，樣品本身含有的少量金屬離子螯合劑通常也不會顯著影響檢測反應。FeSO4標準曲線及SIPG 總抗氧化能力，見圖2、圖3。

圖2 FeSO4標準曲線Fig.2 Standard curve of ferrous sulfate

圖3 SIPG 總抗氧化能力Fig.3 Total antioxidation capacity of SIPG at the indicated concentrations

由圖2、圖3 可知，在試驗設計的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，烏賊墨多糖總抗氧化測試混合液的FRAP 值隨著質(zhì)量濃度的增加而迅速增大，當多糖的質(zhì)量濃度上升至設定最大值時，測試液的FRAP 值增大到最大值57.43，此時，多糖的總抗氧化能力最大。結果表明，烏賊墨多糖在所給定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有較強的抗氧化能力，其總抗氧化能力呈現(xiàn)正向量效關系，質(zhì)量濃度每增加2.25 mg/mL，總抗氧化能力均會出現(xiàn)顯著性增強（P<0.01）。

2.3 烏賊墨多糖對羥基自由基的清除能力

羥自由基是自由基中最強氧化劑，幾乎可以與任何大分子作用，導致機體受損和基因突變，引起機體衰老和癌癥的發(fā)生。本試驗利用Fenton 反應測定烏賊墨多糖對Fe2+催化H2O2產(chǎn)生羥基自由基的清除能力。由于羥基自由基可使溴鄰苯三酚紅褪色，所以根據(jù)褪色程度用比色法測定羥基自由基含量。根據(jù)此原理，我們可間接評價抗氧化劑的抗氧化能力。本實驗對羥自由基的清除能力的檢測結果（圖4）類似于上述DPPH 自由基和總抗氧化能力的變化規(guī)律。在所設定的烏賊墨多糖的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的遞增，其對羥自由基的清除能力也逐漸增強，依然呈現(xiàn)正向量效關系，而且，每增加一個濃度梯度，烏賊墨多糖對羥自由基的清除能力就出現(xiàn)一次顯著性上升（P<0.01）。該結果表明，烏賊墨多糖能有效的清除反應體系中的羥自由基，發(fā)揮其抗氧化作用。

圖4 SIPG 對羥基自由基的清除能力Fig.4 Scavenging rates of SIPG at the indicated concentrations against hydroxyl free radicals

2.4 烏賊墨多糖的體外還原力

Fe3+獲得待測物質(zhì)所提供的電子而被還原為Fe2+，從而使得反應體系的顏色發(fā)生改變，表明體系中氧化還原狀態(tài)變化，體系的吸光值增大，說明被測物質(zhì)的還原力越強，抗氧化能力越強。因此，利用此原理可檢測烏賊墨多糖的還原能力。SIPG 還原能力見圖5。

圖5 SIPG 的還原能力Fig.5 Reducing power of SIPG at the indicated concentrations

由圖5 可知，隨著烏賊墨多糖質(zhì)量濃度的增加還原力逐漸增強，在所選濃度范圍內(nèi)，烏賊墨多糖濃度為14.25 mg/mL 時，還原力最強，正向量效關系明顯。差異顯著性分析表明，各相鄰質(zhì)量濃度間均具有明顯的數(shù)據(jù)差異（P<0.01）。

3 結論

本實驗從對羥自由基和DPPH 自由基的清除能力，以及總抗氧化能力和還原能力等四個抗氧化指標綜合評價了烏賊墨多糖的體外抗氧化能力。結果表明，在體外環(huán)境中，烏賊墨多糖抗氧化力明顯。該結果與本課題組前期完成的體內(nèi)抗氧化能力檢測結果一致。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)[12]，烏賊墨多糖能較大范圍內(nèi)弱化化療藥物環(huán)磷酰胺對機體所造成的氧化性損傷，提升化療模型動物正常組織器官的抗氧化能力，減低化療給正常機體所造成的毒副作用。由此可見，烏賊墨多糖或許可作為腫瘤臨床治療中使用的細胞保護劑的候選藥物進行開發(fā)，必將具有重要的經(jīng)濟與社會效益。

[1]謝光臨,呂昌龍,洪明標,等.烏賊墨促凝血作用機制的實驗研究[J].中國醫(yī)科大學學報,1994,23(6)：530-531

[2]Takaya Y,Uchisawa H,Matsue H,et al.An investigation of the antitumor peptidoglycan fraction from squid ink[J].Biol Pharm Bull,1994,17(6)：846-849

[3]杜鐵平,周培根,衛(wèi)小怡,等.烏賊墨抗菌活性的分離與研究[J].現(xiàn)代食品科技,2005,21(1)：69-71

[4]雷敏,王靜鳳,李兆杰,等.烏賊墨制品對60Coγ 輻射損傷小鼠造血功能的影響[J].食品科學,2007,28(2)：293-297

[5]陸通,高春義,朱有名,等.烏賊墨升白作用的研究[J].實用中西醫(yī)結合雜志,1995,8(3)：163-164

[6]劉華忠,王光,郭宜重,等.烏賊墨對環(huán)磷酰胺致小鼠腎臟氧化性損傷的拮抗作用[J].中華腎臟病雜志,2009,25(10)：804-805

[7]王光,劉華忠,吳金龍,等.烏賊墨提取物對氧化性損傷小鼠心肌與腦組織的保護作用研究[J].中國現(xiàn)代應用藥學,2010,27(2)：95-99

[8]王光,潘江球,鐘杰平,等.烏賊墨對環(huán)磷酰胺致小鼠脾臟氧化性損傷的保護效應[J].食品科學,2009,30(11)：219-222

[9]Zhong J P,Wang G,Shang J H,et al.Protective effects of squid ink extract towards hemopoietic injuries induced by cyclophosphamide[J].Mar Drugs,2009,7(1)：9-18

[10]Takaya Y,Uchisawa H,Narumi F,et al.Illexins A,B,and C from squid ink should have a branched structure [J].Biochem Biophys Res Commun,1996,226：335-338

[11]Chen SG,Xu J,Xue CH,et al.Sequence determination of a non-sulfated glycosaminoglycan-like polysaccharide from melanin-free ink of the squid Ommastrephes bartrami by negative-ion electrospray tandem mass spectrometry and NMR spectroscopy [J].Glycoconj J,2008,25：481-492

[12]劉華忠,王光,吳金龍,等.烏賊墨多糖對環(huán)磷酰胺致小鼠部分臟器損傷的緩解效應[J].中國現(xiàn)代應用藥學,2012,29(2)：89-93

[13]師莉莎,劉華忠,吳金龍,等.酶法提取烏賊墨多糖工藝探討[J].食品科技,2011,36(4)：138-141,147

[14]吳金龍,劉華忠,師莉莎,等.烏賊墨多糖提取工藝優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技,2011,32(7)：289-291,296

[15]趙海清,竇君,阿吉艾克拜爾·艾薩.番茄有效成分含量測定及其綜合利用產(chǎn)業(yè)化構想[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2010,38 (29)：16186-16187

[16]吳廣慶,王金亭,鞠秀萍.紫荊花紅色素體外抗氧化活性的研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學,2009(4)：317-318

[17]葛霞,陳婷婷,蔡教英,等.青錢柳多糖抗氧化活性的研究[J].中國食品學報,2011,11(5)：59-63